طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR)

    یکی از مهم ترین روش های شناسایی ساختار ترکیبات آلی، طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) است. به طور کلی، مطالعه جذب تابش فرکانس رادیویی توسط هسته را رزونانس مغناطیسی هسته گویند. این روش برای شناسایی ساختار ترکیبات و یا مطالعات سنتزی ابزار بسیار قوی تر و بهتری از دیگر روش های طیف بینی مولکولی ست. اما به دلیل گران تر بودن دستگاه و هزینه های آنالیزی مانند روش طیف بینی IR متداول و در دسترس نیست. این روش بر مبنای اندازه گیری تابش الکترومغناطیس در محدوده فرکانس رادیویی 600-4 مگاهرتز می باشد. در این روش برخلاف دیگر روش های طیف بینی مانند IR و UV/Vis، که در آنها الکترون ها در فرایند جذب و انتقالات انرژی درگیر هستند، هسته اتم ها درگیر فرایند جذب هستند.

اصول طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای

برخی هسته های اتم های خاص، مانند الکترون به دور محور خود می چرخند و بنابراین خاصیت اسپینی دارند. در حالت عادی اختلاف انرژی بین ترازهای اسپین هسته صفر است و حرکت های چرخشی نامنظمی دارند. اما زمانی که اتم ها در حضور میدان مغناطیسی قوی (یک آهن ربای خارجی) قرار می گیرند، انرژی هسته های این عناصر به علت خواص اسپین و گشتاور مغناطیسی آنها به دو یا چند تراز کوانتیده شکافته می شوند و حالت اسپین آنها در راستا یا مخالف میدان مغناطیسی اعمال شده، تغییر می کند.

  اندازه حرکت زاویه‌ای اسپین در هسته‌ها توسط عدد کوانتومی اسپین هسته (I) مشخص می‌شود. اندازه حرکت زاویه ای همراه با اسپین ذره مضرب صحیح یا نصف مضرب صحیح از ثابت پلانک (h) است. هسته هایی که دارای عدد جرمی فرد، عدد اتمی فرد و یا هر دو (هم عدد جرمی و هم عدد اتمی فرد) باشند، دارای گشتاور زاویه ای اسپین کوانتایی و گشتاور مغناطیسی هستند و در NMR فعال می باشند. اتم های با عدد جرمی فرد دارای عدد کوانتومی اسپین با ضریب ½ دارند. جدول 1 اتم های متداول با عدد کوانتومی اسپین با ضریب ½، درصد فراوانی و حساسیت نسبی آنها را نشان می دهد. با توجه به حساسیت نسبی و درصد فراوانی (جدول 1) ، معمولا حساسیت و سیگنال به نویز دستگاه های NMR برای هسته های غیر پروتونی مانند ¹³C و ¹⁹F در مقایسه با HNMR کمتر است.

جدول 1– اتم های متداول با عدد کوانتومی اسپین با ضریب ½ برای آنالیز NMR، درصد فراوانی و حساسیت نسبی آنها

ایزوتوپ	درصد فراوانی (%)	حساسیت نسبی
1H	99.98	1
13C	1.11	0.000176
15N	0.37	-
19F	100	0.83
31P	100	0.0663
29Si	4.7	0.0078

  یک هسته اسپین دار با جذب کافی تابش الکترومغناطیسی، در حضور یک میدان مغناطیسی از یک جهت‌گیری با انرژی پایین‌تر به یک جهت‌گیری با انرژی بالاتر برانگیخته می شود. طیف بینی رزونانس مغناطیس هسته (NMR)‌ شامل اندازه‌گیری میزان انرژی لازم برای تغییر  هسته‌های اسپین دار از یک جهت‌گیری پایدار به جهت‌گیری ناپایدارتر در یک میدان مغناطیسی است. از آنجا که هسته‌های اسپین‌دار در میدان مغناطیسی در فرکانس‌های مختلف تغییر جهت می‌دهند، فرکانس متفاوتی از تابش جذبی برای عوض کردن جهت‌گیری هسته‌های اسپین‌دار نیاز می‌باشد. فرکانسی که در آن جذب صورت می‌گیرد برای تجزیه و طیف‌سنجی به کار برده می‌شود.

  برای آن که یک هسته در میدان مغناطیسی جذب مناسبی از تابش الکترومغناطیس داشته باشد باید در نمونه از فراوانی بالایی برخودار باشد و گشتاور مغناطیسی نسبتاً بزرگ داشته باشد. هسته‌هایی که هر دو خاصیت مورد بحث را دارند شامل ¹H،¹⁹F ،³¹P  می‌باشند.

  به طور معمول بیشتر اندازه‌گیری‌های ‌NMR برای هسته پروتون ¹H انجام می‌شود. اندازه‌گیری سایر هسته‌ها اغلب با استفاده از روش‌های افزایش علامت به منظور مشاهده طیف، انجام می شود. معمولاً از میان هسته‌هایی با فراوانی نسبی پایین که رزونانس مغناطیس هسته‌ را نشان می‌دهند،¹²C ، ¹⁵N ، ¹⁶O بیشتر مورد توجه شیمیدان‌ها قرار دارد. محدوده فرکانس رادیویی برای هسته هیدروژن بین 60 تا 800  مگاهرتز می باشد. نامگذاری دستگاه های تجاری نیز بر اساس قدرت میدان مغناطیسی و در نتیجه فرکانس رزونانسی پروتون صورت می گیرد به عنوان مثال یک دستگاه NMR 60MHz یعنی قدرت میدان مغناطیسی آن (1.4 تسلا) سبب رزونانس پروتون ها در حدود 60 مگاهرتز خواهد شد.

دستگاهوری طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای

   با توجه به اصول اولیه این طیف سنجی  اجزای مهم  NMR عبارت است از: مگنت یا آهن ربا، منبع مولد فرکانس رادیویی، جای نمونه، آشکارساز و ثبات. شمای کلی یک دستگاه NMR در شکل 1 نشان داده است.

مگنت یا آهن ربا

   مگنت قلب یک دستگاه NMR است زیرا هم حساسیت و هم قدرت تفکیک طیف سنج به شدت به قدرت و کیفیت مگنت (آهن ربا) آنها مرتبط است. هم حساسیت و هم قدرت تفکیک با افزایش قدرت میدان افزایش می یابند. بنابراین کار کردن با بالاترین قدرت میدان یک مزیت است ضمن این که همگنی و تکرارپذیری میدان نیز بسیار با اهمیت است.

خصوصیات و ویژگی های مگنت در تفکیک بالا، دقت، حساسیت و تکرار پذیری آنالیزها بسیار تاثیرگذار است. میدان مغناطیسی القایی ایجاد شده بايد محیطی برای نمونه فراهم کند که تا يك قسمت در 10⁸ همگن باشد و  بايد تا درجه مشابهی در زمان های كوتاه پايدار بماند.  بنابراین گران ترین قسمت دستگاه مگنت آن است.

  هم آهن رباهای دائمی و هم آهنرباهای الكترومغناطيسی با ابعاد بزرگ  در طيف سنج های بکار می روند. بزرگ ترین قسمت دستگاه مربوط به تانکی ست که نقش یک خنک کننده بزرگ برای سیم پیچ ابررسانا را که میدان مغناطیسی ایجاد می کند، دارد. این خنک کننده با دو مایع بسیار سرد، یعنی هلیوم مایع و نیتروژن مایع پر شده است تا دمای 269- درجه سانتی گراد را سیم پیچ فراهم کند. خاصيت مغناطيسی به صورت ميدان القاي مغناطيسی يا چگالی شار مغناطيسی با نماد B و با واحد تسلا (T) در دستگاه واحدهای  SI معرفی شده اند.

 طیف سنج های NMR معمولا با رابطه با فرکانس پروتون حاصل از دستگاه نامگذاری می شوند مثلا ،60MHz, 100MHz یا 400MHz با عبور یک جریان مستقیم از یک جفت سیم پیچ که به طور موازی با میدان مغناطیسی قرار دارند امکان تغییر میدان موثر را بدون از دست رفتگی همگنی میدان فراهم می شود. بنابراین پیمایش میدان مغناطیسی در روش NMR امکان پذیر می گردد.

 

منبع رادیویی

منبع در NMR یک مولد فرکانس رادیویی است که انرژی مورد نیاز برای تغییر جهت اسپین پروتون ها یا هسته های غیر پروتونی دیگر را فراهم می کند. علامت حاصل از منبع به داخل یک جفت سیم پیچ که عمود بر مسیر میدان قرار گرفته اعمال می شود که سبب می شود پرتو تابش قطبیده مسطح شود. منبع باید فرکانس ثابتی نشر کند و برای آنالیزهای با تفکیک بالا باید تا حدودیک قسمت در  10⁸ ثابت باشد.

نمونه

 برای آنالیزهای HNMR نمونه باید در حلالی فاقد پروتون حل شود. معمولا از CCl₄ (تتراکلرید کربن) استفاده می شود. برای استفاده از حلال های دیگر،حلال به کار برده شده یا بخشی از آن باید دوتریوم دار باشد، یعنی به جای هیدروژن مولکول حلال، اتم های دوتریوم قرار گرفته باشد.

  سل نمونه شامل یک لوله شیشه ای استوانه ایست به قطر 5 میلی متر که معمولا حدود 4 میلی متر از نمونه در آن قرار داده می شود. سل نمونه سپس در فضای دو قطب آهن ربا قرار می گیرد. وقتی نمونه وارد دستگاه می شود، یک جریان سریع هوا محفظه نمونه را می چرخاند تا نمونه یکنواخت تری برای بررسی آماده شود. ضمن این که  با چرخش نمونه حول محور خود تمام قسمت های محلول میدان مغناطیسی نسبتا یک نواختی را احساس می کنند.

آشکارساز و ثبات

  هنگامی که نمونه انرژی جذب نماید، جهت گیری مجدد اسپین ها تولید یک سیگنال فرکانس رادیویی می کند. سیگنال حاصل از هسته های در حال رزونانس به وسیله سیم پیچی که ظرف نمونه را احاطه کرده و عمود بر سیم پیچ منبع قرار دارد آشکار می شود. علامت الکتریکی تولید شده کوچک است و برای ثبت شدن باید تقویت گردد (با ضریبی برابر با 10⁵ يا بيشتر ).

 

 آنالیز کمی و کیفی طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای

  حساسیت روش NMR برای اندازه گیری کمی از روش های طیف سنجی جذبی دیگر  کمتر است. طبق رابطه توزیع بولتزمن نسبت جمعیت هسته ها در تراز پایه به تراز برانگیخته به صورت زیر بیان می شود:

N_j/N₀=(g_j/g₀)e^-E_j/KT                                                           (1)

   که در آن N_j و N₀ تعداد هسته ها در حالت برانگیخته (ترازj ) و تراز پایه، g_j و g₀ وزن های آماری این ترازها، E_j اختلاف انرژی تراز برانگیخته و پایه، K ثابت بولتزمن و T دما ( برحسب کلوین) هستند. برای یک دستگاه MHz 60 مگاهرتز تعداد هسته های مازاد 9 و در دستگاه MHz 600 این تعداد به 96 افزایش می یابد.

   طیف بینی NMR به دلیل میزان و کیفیت اطلاعاتی که فراهم می آورد، روشی ست که اساسا برای آنالیز ساختاری به کار می رود. اما در مواردی نیز برای اندازه گیری کمی مخلوط ها از آن استفاده می شود.

 آنالیز کمی فقط زمانی امکان پذیر است که سطح زیر پیک سیگنال های مربوط به هر گونه کاملا جدا شده باشد. سطح زیر پیک رابطه مستقیم با تعداد گونه مورد نظر در نمونه دارد. حساسیت و دقت اندازه گیری نیز به نوع هسته مورد نظر دارد. آنالیز می تواند بدون آماده سازی نمونه، بدون تخریب نمونه، بدون خطر آلودگی دستگاه و بدون مراحل استاندارد سازی انجام شود. استفاده از استاندارد داخلی (Internal standard) امکان اندازه گیری غلظت را در نمونه فراهم می کند.  در صورت استفاده از استاندارد داخلی برای شناسایی یک گونه در محلول نیازی به دانستن تمام گونه های موجود در طیف NMR نیست.

  روش افزایش استاندارد (Standard addition) نیز می تواند استفاده شود، اما یکی از مشکلات این روش حفظ ثبات پایداری و حساسیت دستگاه طی آنالیز تمامی استانداردها و نمونه ها ست. در هر صورت دقت آنالیزهای کمی با این روش بالا نیست و با به کار بردن روش های و امکانات ویژه از 1% پایین تر نمی رود.

در سنتزهای آلی HNMR برای محاسبه بازده واکنش بکار می رود. در صنعت نیز HNMR برای آنالیز کمی آب و سایر ترکیبات هیدروزن دار استفاده می شود.

   فرکانس پرتو رادیویی، که توسط یک هسته جذب می شود، تحت تاثیر محیط شیمیایی هسته یعنی الکترون ها و هسته های همسایه اش قرار دارد. تفاوت محیط شیمیایی هسته ها منجر به تفاوت در فرکانس جذبی آنها می شود. در واقع میدانی که توسط هسته احساس می شود از میدان اعمالی کمی متفاوت تر خواهد بود. این اثر را جابجایی شیمیایی (chemical shift) گویند. جابجایی شیمیایی به صورت مستقیم متناسب با قدرت میدان مغناطیسی دستگاه است. هر چه قدر قدرت میدان بیشتر باشد اثر جابحایی شیمیایی مشهودتر خواهد بود. شکل 1 فرکانس ارتعاشی هسته های مختلف برای مطالعات NMR و جابجایی شیمیایی پروتون برای گروه های عاملی مختلف را نشان می دهد. واحد جابجایی شیمیایی قسمت در میلیون (ppm) است.

شکل2- فرکانس ارتعاشی هسته های مختلف و جابجایی شیمیایی پروتون برای گروه های عاملی مختلف برای مطالعات NMR

   با توجه به نوع هسته و سیستم حلالی، وجود یک استاندارد شاهد برای تعیین جابجایی شیمایی یک ترکیب ضروری ست. برای HNMR از تترامتیل سیلان ((CH₃)₄Si, TMS) استفاده می شود که همه پروتون های آن یکسان هستند و پیک تیز و بلندی در بالاترین میدان اعمالی ایجاد می کند. این ترکیب خنثی است، به راحتی در بسیاری از حلال های آلی حل می شود و با تقطیر هم به راحتی از نمونه زدوده می شود. ولی متاسفانه در آب محلول نیست و در مواقعی که حلال آب است از ترکیبات نمکی مشابه TMS استفاده می شود.

 

طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای – تبدیل فوریه (FT-NMR)

  عموما دو نوع طیف سنج برای NMR به کار می رود: موج پیوسته  (Continuous wave, CW) و تبدیل فوریه یا پالسی (pulsed or Fourier transform). طیف سنج های موج پیوسته جزو اولین دستگاه های مورد استفاده بوده اند که در این نوع دستگاه ها میدان مغناطیسی را به شیوه ای پیوسته تغییر می دهند.

 در هر دو روش نمونه در یک میدان مغناطیسی با قدرت چندین تسلا قرار داده می شود. نوع موج پیوسته مشابه روش های جذبی عمل می کند یعنی سیگنال جذب نمونه از یک منبع، که در محدوده فرکانس رادیویی اسکن می شود، ثبت می شود. در بعضی دستگاه ها ممکن است فرکانس منبع ثابت نگه داشته شود ولی قدرت میدان تغییر یاید. با تغییر یا پیمایش میدان مغناطیسی ابتدا به اولین نوع از هیدروژن به رزونانس در می آید و آنقدر پیمایش ادامه می یابد تا تمامی انواع هیدروژن ها به رزونانس در آیند. طیف های ثبت شده با این نوع طیف سنج از نوع طیف قلمرو فرکانس (frequency domain) هستند. چون تغییر مکان پیک ها از اختلاف فرکانسی با استاندارد شاهد TMS محاسبه می گردد.

  اکثر دستگاه های امروزی با طیف سنج های تبدیل فوریه تپشی که مجهز به مگنت های ابر رسانا هستند، جایگزین شده اند. در اين روش از يک انرژی قدرتمند ولي کوتاه به نام تپ (پالس) استفاده می شود. قدرت پالس اعمالی به گونه ای ست که کليه هسته های مغناطيسی در مولکول را بطور هم زمان تهييج می کند. برای ایجاد پالس منبع مولد انرژی بسیار سریع روشن و خاموش می شود و تپی را تولید می کند که در بردارنده محدوده ای از فرکانس هاست که مرکز آن، حدود فرکانس اصلی است.

  وقتي تپ متوقف شد، هسته های تهييج شده شروع به از دست دادن انرژی تهييجی خود می کنند و به حالت اسپينی اوليه خود باز می گردند. هسته های برانگيخته شده ضمن آسايش شروع به تابش اشعه الکترومغناطيس می نمايد. چون مولکول حاوی هسته های مختلف بسيار است لذا، فرکانس های گوناگون بسياری نیز از اشعه الکترومغناطيسی به طور هم زمان تابش خواهند نمود. اين تابش را زوال القای آزاد (Free induction decay, FID) می نامند. طیف های ثبت شده با این نوع طیف سنج از نوع طیف قلمرو زمان (time domain) هستند. همان گونه که در نهایت تمامی هسته ها انرژی تهییجی خود را از دست می دهند، شدت FID نیز با گذشت زمان کم می شود. در واقع FID ترکیبی انطباق یافته از تمامی فرکانس های تابش شده است، و می تواند بسیار پیچیده باشد. برای تبدیل سیگنال پیچیده FID و به دست آوردن فرکانس های منفرد مربوط به هسته های گوناگون معمولا روش ریاضی آنالیز تبدیل فوریه (FT)  استفاده می شود.

تصویر برداری تشدید مغناطیسی (MRI)

تکنیک  شناخته شده تصویر برداری تشدید مغناطیسی یا MRIه(Magnetic resonance imaging) نام تغییر یافته NMR در حوزه پزشکی ست که به دلیل ترس عامه مردم، از کلمه هسته ای صرف نظر شده است.

    در MRI نیز از امواج رادیویی برای بدست آوردن اطلاعات استفاده می شود. بدن انسان درون یک حفره بین دو قطب مغاطیسی یک مگنت بسیار قوی (شدتی معادل 60000 برابر میدان مغناطیسی زمین) و منبع امواج رادیویی قرار می گیرد. از آن جایی که در تمام بافت های بدن آب به میزان معینی وجود دارد، بنابراین هیدروژن های مولکول های آب در میدان مغناطیسی تولید سیگنال خواهند کرد. سپس این سیگنال تقویت شده و با کمک رایانه به تصویر تبدیل می شوند. اگرچه مضرات و آسیب های زیانبار تشعشعات مغناطیسی و الکتریکی بالا در MRI مورد بحث است، اما مزایای این روش مانند: غیرتهاجمی بودن، تشخیص بافت های آسیب دیده، اطلاعات مفید و اساسی از ریخت شناسی اندام های بدن و بدون درد بودن را نمی توان نادیده گرفت.

نکات آنالیزی NMR

• تکنیک بسیار قوی در آنالیز کیفی مواد
• كم بودن حساسيت، برای غلظت های کم گونه مورد مطالعه کارایی ندارد.
• تکنیک بسیار گران ست و کار با آن نیاز به مهارت ویژه دارد.
• نگهداری و تعمیر آن هرینه بر بوده و نیار به زیرساخت های ویژه دارد.

 

کاربردهای NMR

• آنالیز های کیفی و شناسایی ساختار ترکیبات آلی و مواد شیمیایی
• مطالعات سینتیکی واکنش ها و تعادل های ساختاری و شیمیایی
• مطالعه ساختار مولکول های بسیار پیچیده مانند پروتئین ها، آنزیم ها، DNA ، کمپلکس های لیگاند-پروتئین و …
• تعیین ساختار مولکولی ترکیبات جامد با استفاده از تکنیک NMR حالت جامد
• مطالعه مغناطیسی جهت ترکیبات پارا مغناطیس
• تصویربرداری های پزشکی