طیف بینی فرا بنفش – مرئی (Uv-Vis)

  طیف بینی فرا بنفش-مرئی یا اسپکتروسکوپی UV-Vis (Ultraviolet and Visible Spectroscopy)i یکی از پرکاربردترین روش های آنالیز مواد  شیمیایی ست. دستگاه اسپکتروسکوپی UV-Vis در بیشتر آزمایشگاه ها برای شناسایی و اندازه گیری ترکیبات آلی و غیرآلی برای محدوده وسیعی از محصولات و فرایندها شامل مواد غذایی، دارو و کود، محصولات پتروشیمی، رنگ ها، اسانس ها، پروتییین ها و نوکلئیک اسیدها به کار می رود. حضور اسپکتروفوتومترها برای بیشتر رشته ها اعم از بیولوژی مولکولی، داروسازی، صنایع غذایی و کشاورزی و .. هم برای کنترل های روزانه و هم تحقیق و توسعه ضروری هستند.

اساس طیف بینی فرا بنفش-مرئی

    اساس طیف بینی جذبی فرابنفش-مرئی (UV-Vis) اندازه گیری میزان جذب یک پرتوی نوری، در محدوده طیفی ناحیه مرئی از طول موج (i380-770 nm) و فرابنفش (i200-380 nm)، با عبور از درون یک نمونه یا بعد از انعکاس از سطح یک نمونه است.

   جذب تابش الکترمغناطیسی در این ناحیه سبب برانگیختگی الکترون ها بین ترازهای الکترونی می‌گردند. هنگامی که مولکولی انرژی جذب کند، یک الکترون از یک اوربیتال اشغال شده به یک اوربیتال اشغال نشده با انرژی پتانسیل بالاتر ارتقا می‌یابد. الکترون های پیوندی، یا الکترون های لایه ظرفیت،بیشتر تحریک شده و معمولا محتمل‌ترین انتقال از بالاترین اوربیتال مولکولی اشغال شده (HOMO) به پایین ترین اوربیتال مولکولی اشغال نشده (LUMO) است.

   وقتی تابش الکترومغناطیسی از درون نمونه ای عبور می کند، بعضی طول موج ها توسط مولکول های نمونه جذب می شوند و مولکول های نمونه با انرژی حاصل از تابش برانگیخته می شوند.

همه ترکیبات آلی قادر به جذب امواج الکترومغناطیس هستند چون همه آنها دارای الکترون در لایه ظرفیت هستند که توانایی برانگیخته شدن به ترازهای بالاتر را دارند. هر الکترون در مولکول انرژی حالت پایه خود را دارد و به حالت های برانگیخته خاصی نیز می تواند انتقال یابد که تمامی این انتقالات براساس محاسبات مکانیک کوانتومی برای هر مولکول مشخص و قابل پیش بینی ست.

بنابراین هرمولکول یا ترکیب طیف جذبی خاص خود را دارد که این طیف یکی از مشخصه های فیزیکی هر ترکیب است که هم برای شناسایی ترکیب (آنالیز کیفی) و هم برای تخمین و اندازه گیری (آنالیز کمی) بسیار کاربرد دارد.

آنالیز کیفی طیف بینی فرا بنفش-مرئی  

   طیف جذبی اتم ها اغلب شامل خطوط بسیار تیزی است که در نتیجه انتقال الکترون بین دو تراز الکترونی مجزا به دست می آید. از آن جایی که اتم ها فاقد ترازهای ارتعاشی و چرخشی هستند، طیف بسیار ساده تری نسبت به مولکول ها دارند.

برخلاف اتم ها، مولکول ها در درجه حرارت اتاق معمولا دارای حالات برانگیخته ارتعاشی و چرخشی بسیاری هستند و به همین دلیل جذب UV برای آن ها معمولا در محدوده گسترده ای از طول موج اتفاق می‌افتد. در واقع ارتعاش مولکول ها حتی در صفر مطلق هم می تواند صورت پذیرد.

از آنجایی که ترازهای چرخشی و ارتعاشی روی ترازهای الکترونی قرار دارند، در نتیجه در یک مولکول، برانگیختگی الکترونی و ارتعاشی- چرخشی بطور همزمان می تواند انجام شود. ترازهای انرژی در انتقالات ارتعاشی-چرخشی بسیار نزدیک هم بوده، اختلاف انرژی میان آنها به مراتب کمتر از اختلاف انرژی ترازهای الکترونی است. بنابراین هر انتقال الکترونی شامل تعداد بسیاری از خطوط بوده که با فواصل بسیار جزئی از یکدیگر قرار می‌گیرندکه به علت فواصل اندک این خطوط، طیف سنج قادر به تفکیک بین این خطوط نیست و در نتیجه دستگاه مجموعه ای از آنها را به‌صورت یک طرح کلی ارائه می‌دهد. به همین علت طیف UV یک مولکول شامل یک نوار جذب بوده که مرکز آن نزدیک طول موج انتقال اصلی است.

  اسپکتروسکوپی UV-Vis می تواند ابزار با ارزشی برای شناسایی گروه های عاملی در یک مولکول باشد. جذب UV-Vis معمولا در نتیجه برانگیختگی الکترون های پیوندی صورت می گیرد و در نتیجه طول موج های جذبی می توانند نشان دهنده نوع پیوند در گونه مورد مطالعه باشند. الکترون هایی که در انتقالات الکترونی مشارکت می کنند عبارتند از:

 الکترون های n،π و σ

  الکترون های n الکترون غیر پیوندی بوده که به صورت موضعی در اطراف اتم هایی مانند اکسیژن، گوگرد، نیتروژن و هالوژن ها مستقر می شوند. الکترون های π که مربوط به پیوندهای پای (هم پوشانی موازی دو اوربیتال p) بین دو اتم هستند. الکترون های σ که مربوط به پیوند ساده بین دو اتم  هستند. چهار نوع انتقال بین سطوح پیوندی و ضد پیوندی در زیر نشان داده شده است :

σ→σ^{*   و}    n→σ^*

 n→Π^{*   و}   Π→Π^*

شکل 1- چهار نوع انتقال بین سطوح پیوندی و ضد پیوندی

   انتقالات σ→σ^* به انرژی زیادی نیاز دارند و در طول موج های کوتاه صورت می گیرند. به عنوان مثال متان که فقط این انتقال را دارد هیچ جذبی در ناحیه فرابنفش  ندارد. انتقالات  ^*n→σ به انرژی کمتری نیاز دارد و معمولا در محدوده طول موجی 250-150 نانومتر اتفاق می افتند. بیشتر ترکیبات آلی غیر اشباع حاوی یک یا چند هترو اتم در این محدوده جذب دارند.

بیشتر کاربرد اسپکتروسکوپی UV-Vis براساس انتقالات  ^*n→Π و ^*Π→Π است. انرژی مورد نیاز برای این نوع از انتقالات الکترونی در محدوده 700-200 نانومتر قرار دارند. هردو این انتقالات به دلیل وجود پیوندهای غیراشباع دوگانه، سه گانه یا آروماتیکی در ساختار مولکول روی می دهند. وجود گروه های کروموفور، یک گروه مولکولی که معمولا حاوی پیوندهای π است، در کنار پیوندهای غیراشباع سبب کاهش انرژی انتقال و در نتیجه جابجایی طول موج جذبی به طول موج های بلندتر می شود.

الکترون در اوربیتال های d و f

بیشتر یون های فلزات واسطه در ناحیه UV-Vis جذب دارند. برای سری لانتانیدها و اکتنیدها این انتقالات مربوط به الکترون های 4f و 5f و برای سری اول و دوم فلزات واسطه الکترون های 4d و 3d هستند.

الکترون های انتقال بار

   گونه هایی که انتقال بار انجام می دهند به دلیل ضریب جذب مولی بالایی که دارند از اهمیت زیادی برخوذدارند. کمپلکس هایی که عمل انتقال الکترون در آنها صورت می گیرد کمپلکس های انتقال بار می گویند که در آنها یک گروه دهنده الکترون (electron donor) در کنار یک گروه گیرنده الکترون (electron acceptor) قرار می گیرند مانند بیشتر کمپلکس های آلی-فلزی.

آنالیز کمی و کیفی با اسپکتروسکوپی UV-Vis

   تقریبا بیشتر آنالیزهای کیفی در آزمایشگا ه های دارویی و بیولوژی با اسپکتروسکوپی UV-Vis انجام می شود. برای گونه هایی که جاذب نیستند نیز با انجام واکنش های رنگ سنجی قابل انجام است. در مقایسه با روش هایی مانند اسپکتروسکوپی مادون قرمز (IR)،اسپکتروسکوپی UV-Vis اطلاعات کیفی محدودی فراهم می کند.

   همانند روش طیف سنجی جذب اتمی، در این روش نیز جذب انرژی نورانی توسط الکترون ها در حالت پایه صورت می گیرد که سبب تهییج الکترون ها به تراز بالاتر و حالت برانگیخته می شوند. شدت نور کاهش یافته با گذر از نمونه و جذب توسط اتم ها متناسب با تعداد مولکول های است که طول موج را جذب کرده اند. جذب (Absorbance, A) و عبور (Transmittance, T) با روابط زیر تعریف می شوند:

A=log(I₀/I)                    (1)

                          T=(I₀/I)×100                         (2)

با استفاده از قانون بیر-لامبرت رابطه بین شدت نور و غلظت مولکول ها تشریح می شود که با رابطه ساده شده زیر بیان می گردد:

A=log(I₀/I)=εbc                          (3)

   که در آن A جذب، I₀ شدت نور تابشی از منبع، I شدت نور عبوری از نمونه، ε ضریب جذب مولی، b طول مسیر و c غلظت گونه ها یا مولکول های مورد نظر ست. ضریب جذب مولی از ویژگی های هر مولکول است که به احتمال انجام انتقال الکترونی و مشخصات ساختاری مولکول وابسته است و تابع پارامترهای متغیر در شرایط انجام آنالیز نیست.

 با مقدار جذب خوانده شده از دستگاه بر حسب غلظت محلول های استاندارد، می توان منحنی کالیبراسیون رسم کرد و سپس از آن برای اندازه گیری غلظت یک نمونه مجهول استفاده کرد. هنگام آنالیز باید به این نکته توجه شود که محلول های استاندارد و نمونه های مجهول در شرایط یکسانی (طول موج، حلال، دما و pH و .. یکسان) اندازه گیری شوند و گرنه نتایج نادرستی بدست می آید.

دستگاهوری طیف بینی فرا بنفش-مرئی 

    همان طور که گفته شد دستگاه اسپکتروسکوپی UV-Vis باید قادر به اندازه گیری جذب و عبور نور در این ناحیه طیفی باشد. از نظر دستگاهوری اسپکتروفتومتر ها به دو دسته تک پرتوی (single beam) و دو پرتوی (double beam) تقسیم می شوند.

در اسپکتروفتومتر های تک پرتوی تمام نور فقط از نمونه عبور می کند. این نوع به دلیل ساده بودن سیستم نوری پیچیدگی کمتری داشته و ارزان تر هستند. در نوع دو پرتوی نور قبل از این که به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفکیک می شود تا خواندن منبع و نمونه به طور همزمان انجام می شود. اندازه گیری همزمان نمونه و مرجع سبب می شود تا در کنار سرعت و دقت بالا، نتیجه آنالیز تحت تاثیر نوسانات و تغییرات فرکانس و شدت منبع نور و آشکارساز قرار نگیرد. شمای کلی یک دستگاه اسپکتروسکوپی UV-Vis از نوع دوپرتوی در شکل 2 نشان داده شده است.

 

معمولا مانند بیشتر دستگاه های نوری یک دستگاه اسپکتروسکوپی UV-Vis از نوع دوپرتوی  شامل اجراء زیر است:

منبع

   همانند مشخصات ایده آل منابع نوری، در این روش هم منبع نوری باید شدتی ثابت در محدوده طول موجی مورد نظر با حداقل نویز و پایداری طولانی داشته باشد. دو منبع معمول برای اسپکتروسکوپی UV-Vis که تا حدی مشخصات فوق را نشان می دهند لامپ دوتریوم و لامپ تنگستن هستند.

لامپ دوتریوم از منابع پیوسته ایست که شدت مناسبی در ناحیه مریی دارد. نویز این منبع معمولا یکی از علل محدودیت در کارایی دستگاه است اگرچه در دستگاه های امروزی سعی شده تا حد زیادی آن را کاهش دهند. لامپ تنگستن برای کل ناحیه طیفی UV-Vis شدت مناسبی دارد و عمر مفید آن بسیار بیشتر از لامپ های دوتریومی ست. معمولا هر دو منبع برای دستگاه های  UV-Vis به کار می روند. لامپ های زنون از جمله منابع پرشدتی هستند که در کل ناحیه طیفی UV-Vis شدت مناسبی دارند. لامپ های زنون به دلیل نویز بیشتری که از دو منبع لامپ دوتریوم و لامپ تنگستن دارند فقط برای اندازه گیری انعکاس نفوذی، که به منابع با شدت بالا نیاز است، به کار می روند.

طیف سنج یا انتخابگر طول موج

    تفکیک طول موج های پرتو نوری می تواند بر اساس منشور (prism) یا توری (grating) باشد. اگرچه استفاده از منشور در طیف سنج ها ارزان تر و ساده تر است اما به دلیل پاشندگی غیرخطی و حساسیت دمایی در دستگاه های مدرن به کار برده نمی شوند. امروزه بیشتر طیف سنج ها از تک رنگ کننده های گریتینگ دار استفاده می کنند.

آشکارساز

دو نوع آشکار ساز معمولا در این روش استفاده می شود: لوله های تکثیرکننده فوتونی (PMT) و فوتو دیودها (Photodiode Detectors).

آشکارساز PMT حساسیت خوبی در کل ناحیه طیفی مرئی و فرابنفش دارد و پاسخ مناسبی به نورهای ضعیف و جذب های پایین دارد.

  آشکارسازهای فوتودیودی از مواد نیمه هادی تشکیل شده اند که با تابش نور جریانی از الکترون در آن ایجاد می شود تا توسط خازن های که در سراسر آشکارساز بهم متصل هستند تخلیه شوند. مقدار باری که برای شارژ دوباره خازن ها در فواصل زمانی منظم مورد نیازاست متناسب با شدت نور است. اگرچه فوتودیودها حساسیت کمی در ناحیه فرابنفش داشتند اما به نظر می رسد این محدودیت تا حد زیادی در دستگاه های مدرن امروزی برطرف شده است.

   فوتودیودها محدوده دینامیکی وسیع تری از PMT ها دارند. بیشتر دستگاه های مدرن و امروزی به جای یک آشکارساز از آرایه ای از چندین فوتودیود که در کنار هم قرار می گیرند، که به آنها آشکارسازهای آرایه دیودی (Diode Array Detectors, DAD) می گویند، استفاده می شود. بسته به دستگاه و کاربری آن آرایه ها بین 200 تا 1000 عدد متغیر هستند. مزیت عمده آشکارساز DAD فراهم شدن امکان اندازه گیری همزمان در محدوده طول موجی مورد نظر است.

سل نمونه

  جای نمونه یا کووت (Cuvette) باید از موادی باشد که در ناحیه مریی و فرا بنفش جذب نداشته و شفاف باشند. این مواد می توانند پلاستیک، شیشه یا کوارتز باشند. شیشه و پلاستیک نور UV را جذب می کنند بنابراین برای آنالیز در ناحیه مریی مناسب هستند. اغلب سل ها از جنس کوارتز هستند که برای هر دو ناحیه مرئی و فرابنفش مناسب است. طول سل ها معمولا 1 سانتی متر است.

   حلال های مورد استفاده باید در ناحیه طول موجی جهت آنالیز شفاف بوده و جذبی نداشته باشند. نباید مزاحمتی در جذب گونه های دیگر داشته باشند. حلال های قطبی به دلیل برهم کنش های بین مولکولی تمایل بیشتری دارند تا جزییات ساختاری در طیف مولکولی را از بین ببرند. مهم ترین حلال های مورد استفاده که در این محدوده جذب ندارند عبارتند از: آب، اتانول، دی اکسان، هگزان، استن.

   نکات آنالیزی طیف بینی فرا بنفش-مرئی

• نمونه باید به صورت محلول شفاف باشد ریرا محلول های مات باعث پراکندگی نور می شوند.
• همیشه اندازه گیری در طول موج ماکزیمم (λmaxλ) انجام می شود تا بیشترین حساسیت کمترین، حد تشخیص و کمترین خطا بدست آید.
• حد تشخیص روش در حد ^4-10 تا ^6-10 مولار است.
• گرینش پذیری مناسب و صحت %3-1 را دارد.
• اپراتوری آسانی دارد و جمع آوری و تفسیر نتایج آن پیچیده نیست.
• هم برای آنالیز کمی و هم کیفی گونه های آلی و غیر آلی کاربرد دارد.
• همیشه روش خوبی برای آنالیز کیفی نیست چون معمولا بیشتر گونه ها حداقل (Minima) یا حداکثر(Maxima) جذب را ندارند.
• اگر نمونه های استاندارد موجود باشد امکان آنالیز نمونه های جامد نیز با این روش وجود دارد.

کاربردها طیف بینی فرا بنفش-مرئی

• اندازه گیری کمی و کیفی گستره وسیعی از مواد آلی شامل مواد غذایی، دارو و کود، محصولات پتروشیمی، رنگها و اسانس ها و پروتییین ها و نوکلئیک اسیدها، اسیدهای آمینه
• اندازه گیری ترکیبات معدنی، آلی فلزی و فلزات سری اکتنیدها و لانتانیدها
• اندازه گیری سرعت و اطلاعات ترمودینامیکی و سینتیکی واکنش های شیمیایی
• اندازه گیری فعالیت آنزیمی