کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)

   کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (High performance liquid Chromatography) که پیشتر به نام کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (High pressure liquid chromatography) نیز نامیده می شد، مهم ترین و متداول ترین روش کروماتوگرافی ست که برای محدوده وسیعی از مواد غیر فرار در زمینه های مختلف علوم کاربرد گسترده ای دارد. در دهه 1960 با بهره گیری از پژوهش های انجام شده، مشخص شده بود که کاهش اندازه ذرات فاز ساکن، سبب افزایش کارایی ستون می شود. چون ستون ها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است به اين جهت قابليت نفوذ كم می شود و برای اين كه حلال جريان داشته باشد، بايد فشار وجود داشته باشد. با کاهش قطر ذرات به 10-3 میکرومتر و تکامل انواع ستون ها و توسعه انواع پمپ ها برای تامین فشار بالاتر و سرعت جریان یکنواخت و پایدار، در اواسط دهه 1970، جداسازی ترکیبات مشابه عملی گردید و کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا به دستگاهی کارآمد و مهمی در بسیاری از زمینه های تحقیقاتی و صنعتی نظیر صنایع آرایشی، غذایی، دارویی، صنایع زیست محیطی و تولید انرژی و .. تبدیل شد.

   در کروماتوگرافی مایع، فاز متحرک مایع است و فاز ثابت ممکن است مایع یا جامد باشد. نمونه ابتدا در یک حلال حل شده و سپس وارد ستون می شود و تحت فشار بالا جریان می یابد. انواع مختلفی از برهم کنش ها و نیروهای مولکولی در فرایند بازداری موثر هستند. کروماتوگرافی مایع بر اساس نیروهای موثر و در نتیجه مکانیسم جداسازی و نوع فاز ساکن به انواع: کروماتوگرافی تقسیمی (Partition chromatography)، کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption chromatography)، کروماتوگرافی تعویض یونی (Ion-exchange chromatography)، کروماتوگرافی اندازه-طردی (Size-exclusion chromatography)، کروماتوگرافی کایرال (Chiral chromatography) و کروماتوگرافی افینیته (Affinity chromatography) تقسیم می شود. کروماتوگرافی تقسیمی کاربرد بیشتری از انواع دیگر دارد و جداسازی حل شونده ها بر مبنای قابلیت متفاوتشان در تقسیم بین فاز متحرک و ساکن استوار است.

دستگاهوری کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

شمای کلی یک دستگاه HPLC در شکل 1 نشان داده شده است. قسمت های اصلی عبارتند از:

1- مخازن حلال

 یک دستگاه HPLC به یک و یا تعداد بیشتری مخازن شیشه ای مجهز است که گنجایش  500 میلی لیتر و یا بیشتر حلال را دارا هستند. مخازن اغلب به گاززدا (degasser) برای حذف گازهای حل شده مجهزند. وجود گازهای مانند اکسیژن و نیتروژن در فاز متحرک که با تشکیل حباب همراه است، سبب پهن شدن پیک می شوند و علاوه براین، اغلب با عملکرد آشکارساز تداخل می کنند.

فاز متحرک باید خلوص بالا، واکنش پذیری پایین و سمیت و اشتعال پذیری کم داشته باشد. در انتخاب حلال برای آنالیز مواد، نقطه جوش حلال، که باید 50-20 درجه بالاتر از ستون باشد، و قابلیت تطابق حلال با آشکارساز نیز باید مد نظر قرار گیرند.

2- پمپ

 چون ستون ها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است، به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین و کنترل شده آن را از ستون عبور می دهد. یک پمپ مناسب باید بتوانند فشاری حدودpsi 6000 تولید کند، خروجی یکنواخت و بدون پالس و بدون فشار برگشتی (back pressure) داشته باشد، سرعت جریان های در گستره 10-0.1 میلی لیتر بر دقیقه (mL/min) را با تکرارپذیری مناسب تامین کند و اجزای مقاومی در مقابل خوردگی داشته باشد.

انواع پمپ های متداول مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا:

• پیستونی رفت و برگشتی (Reciprocating Piston pumps)
• پمپ جابجایی یا سرنگی (Screw driven syringe pump)
• پمپ بادی (Pneumatic pumps)

متداول ترین پمپ مورد استفاده (بیش از 90%) در دستگاه های تجاری HPLC از نوع پیستونی  هستند. پمپ های پیستونی از طریق حرکت رفت و برگشتی پیستون در یک محفظه هیدرولیک حلال را انتقال می دهند. دو شیر یک طرفه که به تناوب باز و بسته می شوند جریان حلال به داخل و خارج سیلندر را کنترل می کنند. پمپ های پیستونی فشار خوبی تولید می کنند، سرعت جریان ثابت  ایجاد می کنند و برای شویش های ایزوکراتیک و گرادیانی مناسب هستند اما جریان تپی ایجاد می کنند که در صورت عدم حذف آن سبب ایجاد نوفه (نویز) در خط پایه کروماتوگرام می شود.

پمپ ها به دو روش عمل می کنند: ایزوکراتیک (Isocratic) و گرادیانی.

 در روش ایزوکراتیک ترکیب ثابتی از حلال منتقل می شود. بنابراین در استفاده از دو یا چند حلال از قبل مخلوط را با نسبت های مورد نظر آماده کنیم (در واقع پمپ فقط از یک مخزن، حلال برداشت می کند). بنابراین ترکیب فاز متحرک در طول آنالیز ثابت است. این روش برای جداسازی های ساده بسیار مناسب هستند. این نوع پمپ ها به خاطر عملکرد ساده ای که دارند ارزان تر هستند.

در نوع گرادیانی ترکیب متغیری از حلال منتقل می شود. قابلیت برداشت از چند مخزن حلال وجود دارد. ترکیب فاز متحرک در طول آنالیز متغیر است. برای جداسازی های پیچیده بسیار مناسب هستند.

 3- تزريق كننده نمونه

    محفظه تزریق نمونه، برای وارد کردن نمونه به فاز متحرک است. ساده ترین وسیله برای وارد کردن نمونه، تزریق سرنگی از درون یک درپوش الاستیک است. متداول ترین روش وارد کردن نمونه در کروماتوگرافی مایع، بر اساس حلقه های نمونه بردار (sample loop) استوار است. حلقه های نمونه بردار قابل تعویض بوده و ظرفیت آنها از 500-5 میکرولیتر است. برای دست یابی به کارایی بالا ستون، نمونه باید در اندازه مناسب و به صورت توده ای (plug) ، وارد ستون شود. تزرق آرام و اندازه نامناسب نمونه باعث پخش شدن آن در ستون و جداسازی ضعیف می شود.

4-ستون

  ستون های کروماتوگرافی مایع معمولاَ از لوله های فولاد ضد زنگ  با منفذ یکنواخت ساخته می شوند و طول آنها حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. قطر داخلی ستون های مایع اغلب 4 تا mm 10 است . متداول ترین اندازه پرکننده ها 5 و µm 10 هستند. این ذرات اغلب با فیلم های نازکی از مواد آلی اندود گردیده اند که به طور شیمیایی و یا فیزیکی به سطح پیوند شده اند.

  در ستون های اولیه این روش، فاز ساکن یک مایع امتزاج ناپذیر با فاز متحرک است که با جذب سطحی فیزیکی روی سطح پرکننده نگه داشته شده است. امروزه ستون های فاز پیوندی (Bonded-phase) با مزایای بیشتری که نسبت به ستون های اولیه دارند، کاملا جایگزین ستون های قبلی شده اند. در این ستون ها فاز ساکن به صورت شیمیایی  به سطح تکیه گاه متصل می شود. پرکننده های فاز-پیوندی اغلب از سیلیس یا ترکیبات با پایه سیلیس تهیه می شوند. این پرکننده ها ذرات یک نواخت، متخلخل، و محکم با قطر 10-3 میکرومتر می باشند.

براساس قطبیت نسبی فازهای متحرک و ساکن کروماتوگرافی، به دو دسته تقسیم می شود:

-کروماتوگرافی فاز نرمال (Normal phase): فاز ساکن قطبی و فاز متحرک غیرقطبی ست. فاز پیوندی به پایه سیلیکایی  ترکیبات آمینو  (-C₃H₆NH₂) و سیانو  (-C₂H₄CN) و فاز متحرک حلال های غیر قطبی مانند هگزان و ایزوپروپیل اتر

– کروماتوگرافی فاز معکوس (Reverse phase): فاز ساکن غیرقطبی و فاز متحرک قطبی ست. فاز پیوندی به پایه سیلیکایی معمولا ترکیبات هیدروکربنی (C_{8  و}  C₁₈) و فاز متحرک حلال های قطبی مانند آب، اتانول، استونیتریل، متانول و ..

در كروماتوگرافي فاز نرمال، جزء با كمترين قطبيت کمتر بازداری می شود و زودتر از ستون خارج می شود، زيرا از همه بيشتر در فاز متحرك حل مي شود. با افزایش قطبیت فاز متحرک، زمان شويش كاهش مي يابد. برعكس، در روش فاز معكوس، قطبي ترين جزء ابتدا ظاهر مي شود و افزايش قطبیت فاز متحرک، زمان شويش را افزايش مي دهد.

ستون محافظ (guard column) وظیفه حفاظت از ستون اصلی را به عهده دارد و نمونه پس از تزریق ابتدا وارد این ستون می شود و سپس وارد ستون تجزیه ای (Analytical column) می گردد به همین جهت به این ستون ها پیش ستون (Pre-column) نیز می گویند. طول این ستون ها در حد چند سانتی متر بوده و با مواد پر کننده مشابه ستون تجزیه ای پر می شوند. به این دلیل که اگر ماده ای در نمونه حضور داشته باشد که با ذرات ستون وارد واکنش می شود در ستون محافظ به دام افتاده و ستون تجزیه ای آسیبی نبیند.

5-آشكارساز

  آشکارسازها گستره وسیعی از وسایلی پیچیده و حساس هستند که به حضور اجزاء موجود در فاز متحرکی که از ستون خارج می شود، پاسخ الکتریکی مناسبی می دهند. اگر آشکارسازی بتواند به تمام انواع نمونه های موجود پاسخ قوی دهد یک آشکارساز عمومی (universal) و اگر فقط به گروه یا ترکیبات ویژه ای واکنش نشان دهد، یک آشکارساز انتخابی ست.

 یک آشکارساز ایده آل باید حساسیت مناسب داشته، پایدار باشد، و از دقت، صحت و تکرارپذیری مناسبی برخوردار باشد. حد تشخیص (detection limit) و گستره خطی (linearity range) آشکارساز برای آنالیزهای کمی بسیار اهمیت دارد.

آشکارسازهای در کروماتوگرافی مایع به دو دسته کلی تقسیم می شوند. آشکارسازهای خاصیت – توده (bulk-property) که به خاصیت توده ای فاز متحرک مانند ضریب شکست، ثابت الکتریکی، چگالی و ویسکوزیته پاسخ می دهند و آشکارسازهای حل شده-خاصیت (solute-property) که به خاصیت جسم حل شده پاسخ می دهند مانند فلورسانس و جذب. در جدول 1 انواع آشکارسازهای متداول HPLC  همرا با توصیفی از زمینه کاربردی و محدودیت هرکدام ارائه شده است.

جدول 1 آشکارسازهای مورد استفاده در HPLC و  مقایسه عملکرد و ویژگی آنها

آشکارساز جذبی ماوراء بنفش-مرئی  (UV/VIS absorption detector, UV/VIS)

 متداول ترین آشکارساز مورد استفاده در HPLC است. فاز متحرک خروجی از ستون وارد یک سل کوچک می شود . این سل در واقع محفظه نمونه یک طیف سنج جذبی است که با برخورد اشعه ماوراء بنفش و مرئی، حل شده های حاوی گروه های کروموفور قسمتی از آن را جذب می کنند. اختلاف شدت جذب نور وقتی که فقط فاز متحرک (بدون نمونه) عبور می کند و وقتی با نمونه عبور داده می شود، نشان دهنده میزان نمونه است.

این آشکار ساز حساسیت و پایداری خوبی دارد. اين آشکارسازها انتخابگر بوده و فقط مي توانند اجزاي نمونه اي كه نور مرئي/ماوراي بنفش را جذب مي كنند، آشكار سازند. آشکارساز UV  در محدوده طول موجی 190-370 nm  و آشکارساز Vis در محدوده طول موجی 400-700 nm کار می کنند ولی بیشتر آشکارسازهای امروزی طوری طراحی شده اند که هر دو محدوده را پوشش می دهند. متداول ترین طول موج مورد استفاده طول موج 254nm است.

آشکارسازهای آرایه دیودی نوری (Photo Diode Array, PDA) از تعداد زیادی دیود با آرایش مناسب تشکیل شده اند که امکان اندازه گیری همزمان بیش از یک نوع جزء جذبی را در طول موج های مختلف فراهم می کنند. آشکار ساز UV/VIS نتایج دو بعدی می دهند یعنی شدت نور بر حسب زمان ولی در PDA بعد سوم طول موج نیز اضافه می شود. این کار منجر به کاهش زمان آنالیز و صرفه جویی در حلال می شود.

آشکارساز جذبی زیر قرمز-تبدیل فوریه (Fourier Transform Infrared, FTIR) براساس جذب امواج زیرقرمز آنالیت استوار است. محدودیت اصلی این آشکارساز  این است که بیشتر حلال های کاربردی و مفید مانند آب و الکل ها برای امواج مادون قرمز عبور کمی دارند (جاذب پرتو تابشی IR هستند) بنابراین کاربرد محدودی دارد.

آشکارساز ضریب شکست (Refractive Index, RI )

اين آشكارساز تغییرات ضریب شکست را اندازه گیری می کند. یک سل شیشه ای به دو محفظه مشابه تقسیم می شود. خروجی ستون وارد محفظه نمونه شده و یک محفظه دیگر فقط از فاز متحرک پر می شود. اگر خروجی ستون حاوی آنالیت باشد، نور تابیده شده در نتیجه اختلاف در اجزاء در دو محفظه سل، شکست می یابد. اندازه این تغییرات نشان دهنده حضور اجزاء نمونه است. این آشکارساز حساسیت کمتری از آشکارسازهای جذبی دارد. به همه ترکیبات پاسخ می دهد. وقتی نمونه ها گروه های کروموفور ندارند، مانند قند، الکل یا یون های غیر آلی، و هم چنین وقتی حلال جاذب نور UV/VIS است، بسیار مفید است. این آشکار ساز قابلیت استفاده در روش شویش گرادیانی را ندارد چون ترکیب فاز متحرک در حال تغییر است.

آشکارساز پراش نور تبخیری  (Evaporating Light Scattering, ELS)

این آشکارساز حساسیت خوبی برای ترکیبات غیرفرار و با جرم مولکولی بالا فراهم می کند. بعد از عبور خروجی ستون از یک محفظه داغ و تبخیر فاز متحرک، ذرات ریز تشکیل شده تحت تابش یک پرتو لیزری قرار می گیرند و پرتو پراش شده برای شناسایی ترکیبات موجود استفاده می شود. این آشکارساز برای شناسایی ترکیبات قندی، چربی ها و ترکیبات با وزن مولکولی بالا بکار می رود. حساسیت بیشتری از آشکارساز RI دارد و با شویش گرادیانی نیز قابل استفاده است.

آشکارساز هدایت سنجی (Conductivity detector)

محلول های حاوی گونه های یونی، رسانایی الکتریکی دارند. آشکارساز هدایت سنجی مقاومت الکتریکی را اندازه گیری می کند که مستقیما متناسب با غلظت یون های موجود در نمونه است. این آشکار ساز  بیشتر برای کروماتوگرافی تعویض-یون بکار می رود. ثابت سل الکتروشیمیایی و دما باید پایدار باشد.

آشکارساز فلورسانس  (Fluorescence, FL)

مزیت عمده این آشکارساز حساسیت و گزینش پذیری بالاست اما ترکیب موردنظر باید که خاصیت جذب فلورسانسی داشته باشد. با استفاده از یک طول موج خاص اتم های آنالیت برانگیخته شده و نشر فلورسانس آنها متناسب با غلظت اتم خواهد بود. برای ترکیباتی که خاصیت فلورسانس ندارند، می توان با مشتق سازی با ترکیبات فلورسانس مانند دنزیل کلراید (dansylchloride) و تبدیل به یک ترکیب فلورسانس آنالیز شوند.

آشکارساز الکتروشیمیایی  (Electrochemical, EC)

انواع مختلف آشکارسازهای الکتروشیمیایی وجود دارد. روش های شناسایی می تواند بر اساس آمپرومتری، ولتامتری، کولومتری و پلاروگرافی باشد. این آشکارسازها گزینش پذیری و حساسیت بالایی دارند، ساده و راحت هستند و دامنه کاربرد وسیعی دارند. بسیار به نویز حساس هستند و هرگونه آسیب یا رسوب گذاری روی الکترود حساسیت را تحت تاثیر قرار می دهد.

آشکارساز طیف سنج جرمی (Mass Spectrometry detectors)

  یکی از قوی ترین آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایعLC  است که تلفیقی از روش LC  و طیف سنج جرمی است و به اختصار LC-MS نامیده می شود. در طیف سنج جرمی جداسازی یون ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) آنها و تحت تاثیر میدان های الکتریکی و مغناطیسی صورت می گیرد. در واقع اجزای نمونه پس از جداسازی در ستون کروماتوگرافی، وارد محفظه یونش طیف سنج جرمی می شوند و با استفاده از میدان های الکتریکی و مغناطیسی شناسایی کمی و کیفی اجزاء نمونه براساس m/z صورت می گیرد.

آنالیز کمی و کیفی

جهت شناسايی کیفی مواد با HPLC از زمان بازداری t_R  استفاده مي شود. زمان بازداری زماني است كه طول مي كشد تا جسم از آشکارساز خارج شود، يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پیک ها روی دستگاه كه براي هر جزئی در نمونه تحت شرايط ثابت، مقداري ثابت است. از مقايسه زمان بازداری  نمونه یا جزء معلوم با زمان بازداری  نمونه مجهول، مي توان اجزاي موجود در نمونه مجهول را تشخيص داد.

آنالیز کمی با استفاده از روش های کالیبراسیون صورت می گیرد. روش استاندارد خارجی (external standard) متداول ترین روش جهت محاسبه مقدار مجهول است که در آن منحنی کالیبراسیون ارتفاع یا سطح زیر پیک از کروماتوگرام محلول های استاندارد (محلول هایی با غلظت های مختلف از استاندارد آنالیت مورد نظر) بر حسب غلظت آنالیت ها در محلول های استاندارد رسم می شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده و با اندازه گیری ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه مجهول مقدار دقیق آنالیت محاسبه می شود.

روش های افزایش استاندارد (standard addition) و استاندارد داخلی (Internal standard) از دیگر روش های کالیبراسیون هستند که برای حذف اثرات ماتریس و خطای موجود در سیستم به کار می روند.

نکات آنالیزی 

• آنالیز ترکیبات غیرفرار و ناپایدار حرارتی
• تنوع زیاد آشکارسازها انتخابی که سبب حساسیت زیاد روش می شود.
• کاربرد گسترده تحقیقاتی و صنعتی
• شناسایی و آنالیز ترکیبات با ساختار مشابه

 زمینه کاربردی

فارماکولوژی (صنعت دارویی): کنترل کیفی برای تطابق محصولات با استانداردها، برای برای تحقیق و توسعه جهت شناسایی  آنالیز داروهای جدید

صنایع عذایی: آنالیز باقیمانده سموم و حشره کش ها، آنالیز پروتئین ها، اسیدهای آمینه، قندها، کلسترول، انواع ویتامین ها و .. ، تشخیص تقلب در مواد غذایی

محیط زیست: آنالیز انواع آلاینده های محیطی در آب و پساب ها

صنعت: بیوتکنولوژی، پتروشیمی و کاتالیز

 

 (UPLC): کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا

در روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا معمولا اندازه ذرات 5-3 میکرومتر و فشار حدود 400 بار است. در روش UPLC ز(Ultra Performance Liquid Chromatography) از ستون های ویژه ای با اندازه ذرات 1.7 میکرومتر و فشار بیش از 1000 بار استفاده می شود. مزیت عمده روش UPLC سرعت آن است. دستگاه های UPLC سریع تر، حساس تر، مصرف حجم های کمتر حلال آلی و در نتیجه توانایی آنالیز نمونه بیشتر در زمان کمتر نسبت به دستگاه های HPLC را دارا هستند. از مشکلات این روش کاهش عمر ستون به دلیل استفاده از فشارهای بالاست.