میکروسکوپ نوری

  در نور مناسب چشم انسان می تواند دو نقطه با فاصله 0.2 میلی متر را بدون استفاده از هرگونه لنز (عدسی) از هم تشخیص دهد. این فاصله را توان تفکیک (resolution power) می نامند. استفاده از یک لنز یا مجموعه ای از لنزها (میکروسکوپ) چشم انسان را به دیدن فواصل کمتر از 0.2 میلی متر قادر می سازد.

  هدف اصلی تمام میکروسکوپ ها بزرگ نمایی (Magnification) تصاویر است. میکروسکوپ های نوری (optical microscope)، قدیمی ترین نوع میکروسکوپ هستند. یک میکروسکوپ نوری مدرن حداکثر تا 1000 برابر بزرگ نمایی دارد. توان تفکیک یک میکروسکوپ فقط به کیفیت و تعداد لنزهای آن بستگی ندارد بلکه به طول موج نوری برای روشنایی نیز مرتبط است. وضوح تصویر در طول موج های بالا بسیار کم است و به همین علت بزرگ نمایی بیشتر از 2000 در میکروسکوپ های نوری امکان پذیر نیست.

اصول میکروسکوپ های نوری

اساس میکروسکوپ های نوری، عبور نور با طول موج های مختلف از چند عدسی محدب است. هرچه قدر طول موج به کار رفته کوتاه تر باشد، قدرت تفکیک میکروسکوپ نوری بیشتر خواهد بود.

میکروسکوپ های نوری از ابزارهای کارامد در مطالعات زیستی، گیاه شناسی و علم مواد هستند. به کمک میکروسکوپ های نوری اجرای سلول زنده جانوران و گیاهان، بافت های مختلف بدن، بررسی اجزاء درونی باکتری ها، جزییات ساختاری یک فسیل، سنگ و خاک، خواص نوری بلورها، شناسایی کانی ها و غیره امکان پذیر است. کار کردن با میکروسکوپ های نوری آسان است و در مقایسه با میکروسکوپ های الکترونی بسیار ارزان تر هستند.

دستگاهوری میکروسکوپ های نوری

میکروسکوپ های نوری از نظر دستگاهوری بسیار ساده تر از انواع میکروسکوپ های الکترونی هستند. میکروسکوپ های نوری بر اساس دستگاهوری تقسیم بندی مختلفی دارند. یک تقسیم بندی مربوط به پیکربندی پایه ای میکروسکوپ های نوری ست که به دو دسته ساده و ترکیبی (compound microscope) تقسیم بندی می شوند. در نوع ساده فقط از یک عدسی یا لنز و در نوع مرکب یا ترکیبی از چند عدسی برای بزرگ نمایی استفاده می شود. اگرچه میکروسکوپ های ساده ارزان تر هستند اما برای کارهای تحقیقاتی نوع مرکب یا ترکیبی بسیار متداول تر است. ضمن اینکه میکروسکوپ های مرکب بزرگ نمایی بیشتر سیگنال به نویز بیشتر و قابلیت هایی مانند کنتراست فاز نیز دارد.

طور کلی اجزاء میکروسکوپ های نوری، شامل سیستم روشنایی یا منبع، لنز هدف، لنز چشمی و فیلتر یا صافی هستند که هرکدام از آنها تاثیر مستقیمی در بزرگ نمایی و کیفیت تصاویر دارند.

   منبع نور یا سیستم روشنایی به منظور ایجاد روشنایی و نور کافی و مناسب جهت وضوح بیشتر تصاویر به کار می رود.  لامپ های نوری معمولا برای سیستم روشنایی میکروسکوپ های نوری به کار می روند عبارتد از: لامپ هالوژن، لامپ جیوه، لامپ زنون و لامپ تنگستن. لامپ هالوژنی شامل یک سیم تنگستنی در یک گاز هالوژن است که نور سفید تولید می کند و از لامپ جیوه ای و زنونی ارزان تر است. لامپ جیوه ای و لامپ زنونی براساس تخلیه الکتریکی کار می کنند ولی لامپ های زنونی پایداری بیشتری از لامپ های جیوه ای دارند. لامپ های تنگستنی از یک فیلامان تنگستنی تشکیل شده اند.  لامپ های تنگستنی ارزان هستند، طول عمر کمی دارند و معمولا برای آزمایشگاه های آموزشی استفاده می شوند.

   منبع نوری می تواند از میکروسکوپ جدا باشد و یا منبع نوری در خود میکروسکوپ قرار داده شود. میکروسکوپ های مدرن امروزی از نوع دوم هستند و منبع نوری در خود میکروسکوپ تعبیه شده است.

   بزرگ نمایی میکروسکوپ های نوری به تعداد لنزها و قدرت تفکیک آنها به توانایی لنزها در جمع آوری نور بستگی دارد. عدسی یا لنزها به دو دسته اصلی تقسیم می شوند: لنزهای هدف یا شیئی (objective lenses) و لنزهای آکولار یا چشمی (Ocular lens). این لنزها با بزرگ نمایی های متفاوتی طراحی شده اند و در لوله میکروسکوپ (barrel) جای می گیرند.لنزهای شیئی معمولا از چند عدسی تشکیل شده اند و نقش آنها تشکیل اولین تصویر از نمونه است. بنابراین عدسی های شیئی مهم ترین بخش هر میکروسکوپ تلقی می شود. لنزهای ابجکتیو بر حسب ترکیب عدسی کارایی و نحوه استفاده از آنها تقسیم بندی می شوند. لنزهای آکولار یا چشمی وظیفه ای مشابه یک ذره بین را ایفا می کنند. تصاویر مجازی ایجاد شده در لنز ابجگتیو را مستقیم و بزرگتر می کند.

 علاوه بر لامپ کندانسور (Condenser) نیز جزء مهمی از سیستم روشنایی میکروسکوپ های نوری ست. کندانسور شامل صافی، عدسی و دیافراگم است که نقش اصلی متمرکز کردن نور بر روی نمونه را دارد. دیافراگم وسیله تنظیم شدت نور است و  انواع مختلفی دارد. با تنظیم دیافراگم میزان نور وردی یا حجم نور قابل کنترل است.

   کنتراست (Contrast) میزان تمایز قایل شدن میکروسکوپ نوری بین نقاط سفید و سیاه یا تاریک و روشن است. هرچه کنتراست بالاتر باشد، تصاویر وضوح و شفافیت بیشتری خواهند داشت. کنتراست تصاویر، در میکروسکوپ نوری به سیستم روشنایی و کندانسور وابسته است. با تغییر شدت نور می توان کنتراست تصویر را کنترل کرد. مواد شیمیایی که به نمونه اضافه می شود نیز در تغییر کنتراست تاثیر مستقیم دارند. یکی از روش های بهبود کنتراست رنگ آمیزی نمونه با مواد شیمیایی است

  بقیه اجزاء میکروسکوپ شامل پایه، پیچ حرکات کند و تند، دسته و صفحه نمونه جزو اجزا مکانیکی میکروسکوپ ها هستند که تاثیر ی بر کیفیت تصاویر ندارند و جهت سهولت کار و کنترل بیشتر دستگاه طراحی های متفاوتی دارند.

  بر حسب منبع نوری و نوع عملکرد، میکروسکوپ های نوری به انواع مختلفی تقسیم می شوند. در ادامه چند نوع از انواع متداول و پرکاربرد این میکروسکوپ ها توضیح داده می شوند.

میکروسکوپ زمینه روشن

استفاده از میکروسکوپ زمینه روشن (Bright Field Microscopy) روشی معمول برای گرفتن تصویر است که در آن زمینه روشن است و کنتراست تصاویر پایین است.

میکروسکوپ زمینه تاریک

  در میکروسکوپ زمینه سیاه (Dark Field Microscope) یا زمینه تاریک، از منبع نور مرئی استفاده می شود و با ایجاد شکست نور، نمونه به صورت شفاف و نورانی در زمینه سیاه دیده می شود. از نظر ساختاری تفاوتی با میکروسکوپ زمینه روشن ندارد جز این که دیافراگم در کندانسور به نحوی ست که قسمت مرکزی غیرشفاف دارد و مانع عبور نور می شود و نور تنها از کناره های دیافراگم و به طور مایل به نمونه می رسد. کنتراست این تصاویر بالاست و معمولا جزییات ساختاری را نیز نشان می دهد.

ميكروسكوپ ماوراء بنفش

   همان طور که از نام آن پیداست، در ميكروسكوپ ماوراء بنفش يا ميكروسكوپ (Ultra Violet Microscope) از یک لامپ ماوراء بنفش یا  U.V به عنوان منبع نوری استفاده می شود. به علت طول موج کوتاه تر نور ماوراء بنفش نسبت به نور مرئی، قدرت تفكيك ميكروسكوپ ماوراء بنفش نسبت به ميكروسكوپ نوری معمولی بالاتر است. شیشه نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می کند و به همین علت لنزهای به کار رفته در این میکروسکوپ از جنس كوارتز هستند. از آنجایی که اشعه ماوراء بنفش برای چشم مضر است، تصویر نمونه به صورت مستقیم رویت نمی شود و بعد از تصویربرداری از نمونه تصاویر بر روی مانیتور قابل مشاهده هستند. ضمن این که پرتو فرابنفش برای سلول های زنده و اجزاء درونی سلول نیز مخرب است و از این روش برای مطالعات زیستی دینامیک کمتر کاربرد دارد.

 میکروسکوپ پولاریزه

  برای آشنایی با نحوه عملکرد میکروسکوپ پولاریزه یا میکروسکوپ پولاریزان (Polarizing Microscope)، ابتدا باید مفهوم نور پلاریزه را دریافت. نور یک موج الکترومغناطیسی ست که در صفحات مختلفی نوسانات الکتریکی و مغناطیسی دارد. در واقع نور در حالت عادی در بیش از یک صفحه نوسان می کند که آن را نور غیرپلاریزه یا پلاریزه نشده (unpolarized light) گویند. به طور کلی نور پلاریزه یا قطبیده نوری ست که فقط در یک صفحه نوسان می کند. روش های مختلفی شامل انتقال (Transmission)، بازتاب (Reflection)، انکسار (Refraction) و پراکندگی (Scattering) برای پولاریزه کردن نور وجود دارد.

  میکروسکوپ پولاریزه برای مواد ناهمسانگرد (anisotropic) استفاده می شود. نحوه انتشار نور در داخل مواد ناهمسانگرد در جهات مختلف منفاوت است. این مواد درست برعکس مواد همسانگرد (isotropic) قرار دارند که نحوه انتشار نور در آنها در تمامی جهات یکسان می باشد. به عبارتی دیگر مواد همسانگرد در همه جهات ضریب شکست مشابهی دارند و به همین علت نحوه انتشار نور در تمام جهات یکس ست در صورتی که مواد ناهسانگرد دو ضریب شکست دارند و بنابراین نور در داخل این مواد در همه جهات انتشار یکسانی ندارد. مواد زیستی مانند فیبرهای گیاهی و حیوانی خاصیت ناهمسانگردی یا شکست دوگانه نور دارند.

  منبع روشنایی در میکروسکوپ پولاریزه باید نور پولاریزه باشد. معمولا با قرار دادن صفحات پولاریزور در جلوی عدسی شیئ برای قطبیده کردن یا پولاریزه کردن نور منبع استفاده می شود.

میکروسکوپ کنتراست فاز

   اگر نمونه بدون رنگ و شفاف باشد و در ماتریسی با خواص مشابه محصور شده باشد، تصویربرداری آن مشکل خواهد بود. علت این امر حساسیت چشم انسان به تفاوت دامنه ها و طول موج ها، و عدم حساسیت به تغییرات فازی ست.

 در میکروسکوپ کنتراست فاز (phase contrast microscope) یا میکروسکوپ اختلاف فاز، از یک منبع نور مرئی استفاده می شود. اما در ساختار نوری این میکروسکوپ از یک صفحه فازی (phase plate) استفاده می شود تا تغییرات کوچک فازی را به تغییرات دامنه تبدیل کند. تا به این ترتیب با تفاوت در کنتراست، تصویری از نمونه به دست آید.

مزیت عمده این میکروسکوپ مطالعه بافت های زنده است. مطالعه سلول های زنده بدون هیچ آماده سازی (تیمار) ، تصویربرداری طولانی مدت از فعالیت سلولی و مطالعه فرایندهای سلولی مانند تقسیم میتوز با این روش امکان پذیر است.

میکروسکوپ تداخلی

  میکروسکوپ تداخلی (interference microscope) یکی از تکنیک های مشتق شده میکروسکوپی فازی ست اما حساس تر از است. در این روش نور منبع توسط یک کندانسور و منشور به دو پرتو تقسیم می شود. یک پرتو از نمونه و لنز شئی عبور می کند و پرتو دیگر (پرتو مرجع) بدون عبور از نمونه فقط از لنز شئی عبور می کند. این دو پرتو بعد از عبور از نمونه و مرجع با هم تلاقی می کنند. و به دلیل تفاوت دو محیطی که دو پرتو از آن عبور کرده اند فازهای متفاوتی داشته و با هم تداخل پیدا می کنند. در نتیجه این تداخل تصویری به دست می آید که امکان دیدن جزئیات نمونه را فراهم می کند.

ميكروسكوپ فلورسانس

اساس ميكروسكوپ فلورسانس (Fluorescence Microscope) پدیده فلورسانس است. تفاوت عمده میکروسکوپ فلورسانس با روش های دیگر این است که در این روش نور تهییجی نشر شده از نمونه، تصویربرداری می شود. فلورسانس، تابش نشر شده از اتم های برانگیخته ای ست که توسط یک منبع تابش تههیج شده اند و نشر فوتون در طول موج های بلندتری از فوتون جذبی اتفاق می افتد. نشر فلورسانس به دو صورت می تواند در نمونه دیده شود. حالت اول شامل موادی ست که ذاتا خاصیت فلورسانسی دارند مانند بعضی از رنگ ها. تعداد معدودی از ترکیبات آلی و معدنی خاصیت فلورسانی دارند. دسته دوم موادی که با رنگ آمیزی یا مشتق سازی خاصیت فلورسانسی پیدا می کنند. مواد فلورسنت نظیر رودامین و فلورسئین از ترکیبات متداول در رنگ آمیزی اجزاء سلول یا پروتئین ها هستند.

در ميكروسكوپ فلورسانس از از یک منبع نوری با پرتوهای ماوراء بنفش یا  U.V مانند لامپ زنون یا جیوه استفاده می شود. در دستگاه های مدرن امروزی از منابع پرقدرت لیزری نیز استفاده می شود.  ترکیب یا ماده فلورسنت نور U.V را جذب کرده و سپس در اثر فلورسانس در طول موج بلندتر (مرئی) آن را منتشر می کنند.

شکل 1 شمای کلی یک ميكروسكوپ فلورسانس را نشان می دهد. با عبور نور منبع از یک آینه دورنگ نما یا دای کروییک (dichroic mirror) و صافی تهییجی (excitation filter) فقط طول موج های ویژه ای به نمونه می رسد. نور فلورسانس نشر شده از نمونه از طریق عدسی هدف و صافی نشری (emission filter) به عدسی چشمی و سپس آشکارساز می رسد. صافی ها مانع از عبور طول موج های ناخواسته می شوند. در نهایت یک تصویر روشن و رنگارنگ از نمونه فلورسنت بدست می آید.

 

  تصویربرداری در میکروسکوپ فلورسانس به دو روش می تواند انجام شود. در روش معمول فقط نور فلورسانس از نور تهییجی منبع جدا می شود و تصاویری با زمینه سیاه به دست می آید. نقاطی که نمونه فلورسانس نشری داشته به صورت تصاویر رنگی دیده می شود. از آنجایی که فقط نور مرئی به چشم یا آشکارساز می رسد، تصویری با تفکیک بالا با زمینه ای کاملا تاریک به دست می آید. چون نور تهییجی بسیار بزرگتر و بیشتر از فلورسانس نشری ست، حذف زمینه بسیار مشکل است.

  در روش اپی فلورسانس  (epifluorescence) نور تهییجی از سیستم روشنایی عمودی، ابتدا وارد کندانسور شده و سپس به نمونه می تابد و نور نشر فلورسانسی نمونه با استفاده از همان عدسی (کندانسور) جمع آوری شده و با استفاده از عدسی شیئ بر روی آشکارساز متمرکز می شود. نمونه نشر فلورسانس خود را در تمام جهات ساطع می کند. در این روش جمع آوری نشر فلورسانسی نمونه در تمام جهات X,Y و Z صورت می گیرد. بنابراین در میکروسکوپ اپی فلورسانس (Epifluorescence Microscope)، با کم کردن نور تهییجی زمینه و جمع آوری نشر فلورسانس از تمام نمونه، سبب افزایش نسبت سیگنال به نویز شده و کیفیت تصویر افزایش می یابد.

  ميكروسكوپ فلورسانس توانایی شناسایی تک مولکول در یک ساختار پیچیده (مانند سلول) را دارد و می تواند توزیع فضایی مولکول ها را در نمونه موقعیت یابی کند. اما در تصویربرداری با این روش نمونه باید فلورسنت باشد و بیشتر نمونه ها که فلورسنت نیستند نیاز به مشتق سازی یا برچسب گذاری شیمیایی (chemical labeling) دارند.

نکات آنالیزی میکروسکوپ های نوری

• تفکیک (resolution) محدودی دارند.
• بزرگ نمایی آنها 2000-1000 است.
• تصایر رنگی هستند و مستقیما با چشم قابل مشاهده هستند.
• توانایی تصویربرداری از سلول های زنده و تحقیقات in-vivo را دارد.
• نسبت به انواع میکروسکوپ های الکترونی و روبشی بسیار ارزان تر و در نتیجه در دسترس تر است.
• قابل حمل هستند و نمونه سازی آسانی دارند.

زمینه های کاربردهای میکروسکوپ های نوری

• مورفولوژی و تقارن کریستالها، تعیین مواد همسان گردی (isotropic) و ناهمسان گردی (anisotropic) مواد
• تشخیص فاز، خلوص و همگنی و آنالیز فاز
• تشخیص تک کریستال (single crystal)، نقص های شبکه کریستالی و مرزبندی دانه ها
• تعیین داده های استاندارد نوری مانند ضریب شکست (refractive index)