کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی (SFC) مبانی دستگاهوری و نکات آنالیزی- آنالیوم

آنالیز اسید های آمینه در نمونه های مختلف

جهت آنالیز اسیدهای آمینه با ما تماس بگیرید

اساس کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی (Supercritical fluid chromatography, SFC) استفاده از سیال فوق بحرانی به عنوان فاز متحرک است. یک سیال فوق بحرانی ترکیبی است که بیش از دمای بحرانی و فشار بحرانی اش گرم و فشرده می شود. دمای بحرانی (Critical temperature, T_c) دمایی ست که بالاتر از آن دما یک ماده نمی تواند به صورت مایع وجود داشته باشد هر چقدر که فشار را بالا ببریم. و به همان صورت فشار بحرانی (Critical pressure, P_c) فشاری ست که بالاتر از آن ماده نمی تواند به صورت گاز وجود داشته باشد هر چقدر که دما را بالا ببریم.

شکل 1 نمودار تغییرات دما-فشار برای یک حلال را نشان می دهد. نقطه سه گانه (Triple Point) یک ماده، نقطه‌ای است که در آن، سه فاز ماده (جامد، مایع و گاز) به صورت همزمان با یکدیگر در حال تعادل ترمودینامیکی هستند.

کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی

به طور کلی هر ماده ای که در دما و فشار بحرانی قرار گیرد سیال فوق بحرانی ست. در نقطه فوق بحرانی، ماده همانند یک فاز حد واسط بین حالت مایع و گاز عمل می کند. یک سیال فوق بحرانی حلالیتی در حد مایع ولی خصوصیات انتقال گاز را دارد. ویسکوزیته پایین تر و قدرت نفوذ بالاتر نسبت به حالت مایع، شناوری و چگالی بالاتر نسبت به حالت گازی، سبب خصوصیات انتقال جرم بهتر این سیال در مقایسه با حلال معمولی می شود. این خصوصیات فیزیکی سبب شد تا سیال فوق بحرانی برای کاربردهای استخراجی و جداسازی مورد توجه قرار گیرد.

حلال هایی که به عنوان سیال های فوق بحرانی برای استخراج استفاده می شوند باید ارزان، بی خطر و غیرسمی، با حلالیت خوب و نقطه جوش پایین باشند مانند دی اکسید کربن (CO₂) ، متان (CH₄) ، آمونیاک (NH₃) و اتیلن (C₂H₂).

سیال های فوق بحرانی حلال های جالبی برای استفاده در کروماتوگرافی به عنوان فاز متحرک هستند و با توجه به خواص حدواسط آنها هم، در کروماتوگرافی گازی و هم کروماتوگرافی مایع قابل استفاده اند. به علت قدرت حلالیت بیشتر امکان جداسازی ترکیبات غیرفرار با وزن مولکولی بالاتر که مناسب آنالیز با کروماتوگرافی گازی نیستند، امکان پذیر است. سرعت نفوذ بالاتر سیال فوق بحرانی کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی را تا ده برابر سریع تر از HPLC می کند. زمانی که از سیال های فوق بحرانی به عنوان فاز متحرک استفاده می شود امکان تاثیرگذاری و کنترل بازداری ترکیبات با تغییر فشار و دما وجود دارد.

در حالت فوق بحرانی چگالی فاز متحرک با تغییر فشار و دما تغییر می کند. با افزایش فشار در دمای ثابت چگالی افزایش می یابد و در نتیجه قدرت حلالیت افزایش می یابد و در نتیجه آنالیت بیشتر در فاز متحرک باقی می ماند و بازداری کاهش می یابد. در واقع در روش SFC علاوه بر تغییر فاز متحرک با تغییر فشار و دما نیز امکان تغییر بازداری وجود دارد.

دستگاهوری SFC

اولین دستگاه تجاری کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی در سال 1982 توسط شرکت HP وارد بازار شد. در ابتدا گمان می رفت که SFC بتواند جای HPLC را بگیرد. اما تکرارپذیری ضعیف SFC در کنار قیمت بالا و اپراتوری مشکل تر آن، تاکنون نتوانسته آن را جایگزین مناسبی برای کروماتوگرافی مایع کند. بهرحال با توجه به مزایای این روش شامل مصرف کم حلال سرعت آنالیز و جداسازی در صنعت داروسازی و زمینه های تحقیقاتی مورد توجه است. ضمن اینکه باید توجه کرد این دو روش رقیب هم نبوده و مکمل هم هستند و ترکیباتی که SFC قابل آنالیز نیستند با HPLC آنالیز می شوند و بالعکس.

فاز متحرک

متداول ترین سیال فوق بحرانی که به عنوان فاز متحرک در SFC استفاده می شود دی اکسید کربن است. دی اکسید کربن به دلیل فشار و دمای بحرانی نسبتا پایین تر (T_c=31.1 ^oc, T_p=72.8 atm) و سازگاری با محیط به عنوان سیال فوق بحرانی مورد توجه بیشتر قرار گرفته و کاربرد گسترده تری دارد. ان حلال هم چنین با بسیاری از سیستم های آشکارسازی قابل استفاده است و تهیه آن با خلوص بسیار بالا به راختی امکان پذیر است.

از آنجایی که CO₂ یک حلال غیر قطبی ست حتی با تغییر چگالی آن قابلیت حل کردن مواد قطبی را در خود ندارد به عنوان مثال در چگالی g cm^-3ز0.25 CO₂قدرت حلالیتی مشابه آلکان های فلوره و در چگالی 0.98 g cm^-3 و کمی قطبی تر از هگزان است. بنابراین از فازهای متحرک دوتایی یا سه تایی برای افزایش قطبیت CO₂ استفاده می شود. محدوده وسیعی از حلال های قطبی مانند متانول، اتانول، بوتانول، استونیتریل، آب و تتراهیدروفوران به صورت اصلاحگر (Modifier) به CO₂ اضافه می شود. متداول ترین اصلاحگر متانول است. اگرچه تاثیر افزودن این اصلاحگرها بر بازداری و گزینش پذیری فاز متحرک پیچیده است آنها ضمن افزایش قطبیت چگالی فاز متحرک و برهم کنش با فاز ساکن را تغییر می دهند.

فاز ساکن

سیال فوق بحرانی هم با ستون های فشرده و هم مویی می تواند به کار رود. با توجه به کارایی بالاتر، ستون هایی مویی برای آنالیز ترکیبات پیچیده تر ارجح هستند. ستون های فشرده برای آنالیز نمونه های ساده تر استفاده می شوند چون هم زمان آنالیز کوتاه تر و هم قابلیت بارگذاری مقدار بیشتری نمونه دارد.

SFC یک روش فاز نرمال است چون شامل یک فاز متحرک غیرقطبی و فاز ساکن قطبی ست بنابراین ستون های غیرقطبی HPLC مانند C₁₈ در روش SFC نیز به کار می روند.

فازهای ساکن کایرال نیز در SFC استفاده می شوند که بیشتر آنها پایه سیلیکایی هستند. ستون های کایرالی که برای HPLC طراحی شده اند می توانند در SFC نیز استفاده شوند.

آشکارساز

از نظر تئوری امکان استفاده از بیشتر آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی و مایع در روش کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی وجود دارد ولی بیشتر آنها به صورت تجاری در دستگاه های SFC در دسترس نیستند.

متداول ترین نوع آشکارساز در SFC آشکارساز ماوراء بنفش (Uv/Vis) است به خاطر حساسیت مناسب، گستره وسیع دینامیکی و هم چنین شفاف بودن فاز متحرک CO₂. آشکارساز پراش نور تبخیری (Evaporating light scattering ) و آشکارساز یونیزاسیون شعله ای (FID) نیز در مواردی می توانند استفاده شوند. مانند همه روش های دیگر، آشکارساز جرمی، به جهت اطلاعات کمی و کیفی بسیار مفیدی که فراهم می آورد، انتخاب بسیار عالی برای این روش نیز هست.

نکات آنالیزی کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی

روش سریع و مدت آنالیز کوتاه است مصرف حلال کمتر است.
علاوه بر تغییر حلال با تغییر فشار و دما نیز می توان بازداری و در نتیجه جداسازی ترکیبات را کنترل کرد.
دستگاه گرانی ست و هنوز با بسیاری از آشکارسازها به صورت تجاری در دسترس نیست.
این روش مسئله دفع و پاک سازی حلال را ندارد و به عنوان یک روش دوستدار محیط زیست (environmentally-friendly) شناخته می شود.