کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) با نام متداول و اختصاری TLC از تکنیک های ساده و کاربردی کروماتوگرافی است. در این روش برای جدا کردن اجزاء یک مخلوط از یک فاز ثابت نازک که روی یک بستر بی اثر قرار گرفته است، استفاده می شود. این تکنیک ممکن است در مقیاس آنالیزی به عنوان ابزاری برای نظارت بر پیشرفت یک واکنش سنتزی یا در مقیاس تهیه ای برای خالص سازی مقادیر کم یک ترکیب استفاده شود. TLC ابزاری آنالیزی است که به دلیل سادگی، هزینه کم نسبی، حساسیت بالا و سرعت جداسازی بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. هدف TLC به دست آوردن نقاط تعریف شده و جدا از هم است.
اساس کروماتوگرفی لایه نازک
صفحات (فاز ثابت)
صفحات TLC (که به عنوان صفحات کروماتوگرافی نیز شناخته می شوند) می توانند در آزمایشگاه تهیه شوند، اما بیشتر آنها به صورت تجاری قابل تهیه می باشند. سیلیکاژل و آلومینا از رایج ترین فاز ساکن هستند، اما سایر موارد نیز در دسترس هستند. برای مرحله تشخیص لکه ها بسیاری از صفحات آغشته به ترکیبی هستند که تحت اشعه ماوراء بنفش موج کوتاه (254 نانومتر) فلورسانس می شوند. بستر بی اثر صفحات TLC اغلب از شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک تشکیل شده است.
حلال (فاز متحرک)
انتخاب صحیح حلال یا فاز متحرک شاید مهم ترین بخش TLC باشد و تعیین بهترین حلال ممکن است به یک آزمایش و خطا نیاز داشته باشد. همانند انتخاب صفحه، خواص شیمیایی آنالیت ها نقش مهمی در کارایی جداسازی داشته و باید آنها را نیز در نظر داشت.
اگر یک جزء از مخلوط در یک حلال معین نامحلول است، اما یکی دیگر از اجزای آن به خوبی در آن محلول است، غالبا جداسازی های خوبی در کروماتوگرافی لایه نازک به دست می آید.
سرعت حرکت ترکیبات به بالای صفحه به دو چیز بستگی دارد:
- اگر ترکیب در فاز متحرک محلول باشد، بیشتر روی صفحه TLC بالا می رود.
- چقدر ترکیب به فاز ساکن تمایل دارد. اگر ترکیب به فاز ساکن تمایل داشته باشد، به آن می چسبد، که باعث می شود خیلی زیاد روی کروماتوگرام حرکت نکند.
اسیدها، بازها و ترکیبات با قطبیت زیاد معمولا در حلال های خنثی، به جای لکه، نوار ایجاد می کنند. افزودن چند درصد اسید استیک یا فرمیک به حلال می تواند نوار حاصل از اسیدها را اصلاح کند. به طور مشابه برای بازها، اضافه کردن چند درصد تری اتیل آمین می تواند نتایج را بهبود بخشد. برای ترکیبات قطبی نیز افزودن چند درصد متانول می تواند نتایج را بهبود بخشد.
مخلوط های حلالی مفید
برای انتخاب سیستم حلال یک نقطه شروع مطلق وجود ندارد. با این حال، موارد زیر به صورت خلاصه کمک کننده می باشد:
- اگر با مولکول های آلی کاملا غیرقطبی کار می کنید (بدون گروه های عاملی قطبی، فقط حاوی C و H )، مانند نفتالین، با پنتان خالص یا هگزان شروع کنید.
- اگر جداسازی ترکیبی که دارای یک یا دو گروه عاملی با قطبیت متوسط (اتر، کتون، استر و …) مد نظر باشد، از مخلوط حلالی 4: 1 هگزان/ اتیل استات شروع کنید.
پیپت یا لوله مویینه
لکه ها با استفاده از پیپت های شیشه ای بسیار نازک روی صفحه قرار می گیرند. لوله مویینه باید به اندازه کافی نازک باشد تا لکه های مرتب داشته باشد، اما آنقدر نازک نباشد که مانع از جذب مقدار کافی آنالیت شود.
یک لوله مویینه شیشه ای را روی شعله چراغ بونزن نگه دارید تا زمانی که قابل انعطاف شود و سپس دو انتهای آن را از هم بکشید تا مرکز لوله مویینه باریک تر شود. لوله مویینه را از مرکز باریک شده نصف کنید و از انتهای نازک برای اعمال نقاط استفاده کنید.
محفظه TLC (تانک TLC)
توسعه حلال روی صفحه TLC به یک اتاقک یا محفظه (تانک TLC) نیاز دارد. یک ظرف شیشه های با دهان پهن مناسب می باشد، اما ظروف تخصصی تر شیشه ای برای قراردادن صفحات بزرگ در دسترس است. محفظه باید حاوی حلال کافی باشد به نحوی که کف آن را بپوشاند. همچنین از یک قطعه کاغذ صافی یا مواد جاذب دیگر برای کمک به اشباع محیط اتاقک با بخارات حلال استفاده کرد. در آخر این که برای به حداقل رساندن تبخیر باید یک درب یا پوشش روی اتاقک قرار داده شود.
مراحل انجام آزمون TLC
- صفحه را به اندازه صحیح برش داده و با استفاده از یک مداد (هرگز از خودکار استفاده نکنید)، به آرامی یک خط مستقیم روی صفحه تقریباً 1 سانتی متر از پایین بکشید. هنگام کشیدن خط روی صفحه TLC از نیروی بیش از حد استفاده نکنید زیرا این کار فاز ساکن را از بین می برد. استفاده از مداد به جای قلم بسیار مهم است زیرا جوهرها معمولا با حلال به بالای صفحه حرکت می کنند.
- با استفاده از پیپت های TLC، لکه آنالیت را روی خط قرار دهید. اطمینان حاصل کنید که نمونه کافی در صفحه مشاهده شده است. در صورت نامرئی بودن لکه این کار با قراردادن صفحه زیر اشعه ماوراء بنفش انجام می شود. باید لکه بنفش دیده شود. اگر لکه قابل مشاهده نباشد، باید نمونه بیشتری در صفحه استفاده شود. اگر استانداردی از ترکیب مورد نظر در دسترس باشد، خوب است که با قراردادن استاندارد روی نقطه ای از مخلوط ناشناخته، یک نقطه مشترک تولید کنید. این کار شناسایی ترکیب هدف را تضمین می کند.
- صفحه را داخل محفظه قرار دهید و به دیواره آن تکیه دهید. سطح حلال نباید از خط کشیده شده بالاتر رود. اجازه دهید که حلال با خاصیت مویینگی روی صفحه بالا رود تا حدی که حدود یک سانتی متر از انتها بماند. هرگز اجازه ندهید که حلال تا انتهای صفحه مهاجرت کند.
- صفحه را برداشته و بلافاصله با مداد یک خط در قسمت جلوی حلال بکشید.
- در صورت نامرئی بودن لکه ها، از نور ماوراء بنفش استفاده کنید و اجزای نشان داده شده را با مداد مشخص کنید.
در تصویر مراحل مختلف انجام کروماتوگرافی لایه نازک نشان داده شده است.
شکل 1- مراحل مختلف انجام کروماتوگرافی لایه نازک
مشاهده لکه
اگر ترکیبات مورد جداسازی رنگی باشند، کار تشخیص ساده است، اما در بیشتر موارد لکه ها رنگی از خود ندارند (نامرئی هستند) در این حالت در صورت استفاده از صفحات دارای خاصیت فلورسانس، با تابیدن اشعه ماوراء بنفش موج کوتاه، برخی ترکیبات را می توان مشاهده کرد. فرونشانی باعث ایجاد نقاط تاریک (محل وجود لکه) روی سطح صفحه می شود. این لکه های تیره با یک مداد علامت گذاری شوند. برای ترکیباتی که اشعه ماوراء بنفش فعال نیستند، می توان از برخی ترکیبات شیمیایی برای ایجاد لکه رنگی مربوط به اجزاء جداشده روی صفحه استفاده کرد. این ترکیبات می توانند عمومی باشند، یا مختص یک مولکول خاص یا یک گروه خاص باشند.
فاکتور بازداری
پس از کامل شدن جداسازی، ترکیبات جداگانه به صورت لکه هایی به صورت عمودی از هم جدا می شوند. هر نقطه دارای یک فاکتور بازداری (Rf) است که برابر با مسافت طی شده توسط جزء مورد نظر تقسیم بر مسافت طی شده توسط حلال است.
مسافت طی شده توسط حلال / مسافت طی شده توسط جزء مورد نظر = Rf
مقدار Rfبا توجه به منحصر به فرد بودن آن برای هر ترکیب (در شرایط مشخص)، میتواند برای شناسایی ترکیبات مورد استفاده قرار گیرد.
مقادیر Rf و تکرارپذیری می تواند تحت تأثیر عوامل مختلفی از جمله ضخامت لایه، رطوبت روی صفحه TLC، اشباع بودن یا نبودن تانک TLC، دما، عمق فاز متحرک، ماهیت صفحه TLC، اندازه نمونه و پارامترهای حلال باشد.
کاربردهای TLC
- بررسی مخلوط های واکنش در طی سنتز ترکیبات مختلف
- انتخاب حلال مناسب برای کروماتوگرافی ستونی
- بررسی خلوص ترکیبات: از TLC می توان برای بررسی خلوص یک ترکیب درحالی که آنالیز در کنار یک مرجع معتبر انجام می گیرد، استفاده کرد.
- آنالیز بیوشیمیایی: TLC اغلب برای جداسازی، مقایسه و مشخص کردن ترکیبات و متابولیت ها در خون، سرم، مایعات بدن و ادرار استفاده می شود.
- صنایع غذایی و آرایشی: از TLC میتوان برای جداسازی و شناسایی اجزای گوناگون رنگ های مختلف، محصولات آرایشی، مواد شیرین کننده و نگهدارنده از سایر مواد استفاده کرد. انجام TLC آسان تر است زیرا نیازی به تجهیزات پیشرفته ندارد و همچنین صرفه جویی در زمان است.
- صنایع دارویی: مطالعات پایداری در جایی که باید ثبات داروهای ذخیره شده مورد آزمایش قرار گیرد. همچنین در تشخیص دارو در مایعات بدن، تشخیص باقیمانده دارو در غذا، تشخیص متابولیت های دارو، نظارت بر خلوص دارو مورد استفاده قرار می گیرد.
تفاوت کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی کاغدی
توجه کنید که کروماتوگرافی لایه نازک اگرچه در روش کار بسیار مشابه کروماتوگرافی کاغدی (Paper chromatography) است اما دو تفاوت اساسی با هم دارند:
- نوع فاز ساکن: در TLC همان طور که گفته شد، فاز ساکن عموما صفحات شیشه ای پوشیده با سیلیکاژل و آلومینا هستند اما در کروماتوگرافی کاغدی از کاغدهای سلولزی استفاده می شود که حاوی آب در منافدخود هستند. در واقع در TLC فاز ساکن سیلیکاژل و در کروماتوگرافی کاغدی مولکول های آب هستند.
- مکانیسم جداسازی: اگرچه هردو روش جزء روش های کروماتوگرافی جامد-مایع محسوب می شوند اما TLC کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption) و کروماگرافی کاغدی یک کروماتوگرافی تقسیمی (Partition) است.
کروماتوگرافی کاغدی ارزان تر است و زمان جداسازی کمتری دارد. بیشتر برای جداسازی ترکیبات قطبی و محلول در آب به کار می رود. برای ارزیابی لکه های جداشده نیازی به نور UV نیست. چون کاغذ به ترکیبات خورنده حساس است، نباید این ترکیبات در نمونه وجود داشته باشند.
کروماتوگرافی لایه نازک هزینه آنالیزی بالاتری دارد و زمان جداسازی و آنالیز با آن طولانی تر است. صفحات TLC را می توان برای جداسازی بهتر در آون حرارت داد. به مواد خورنده حساسیت زیادی ندارد. بیشتر برای ترکیبات با قطبیت کم به کار می رود.
اگر به مطالب بیشتر همراه با مثال های کاربردی در زمینه TLC علاقه مندید مقاله زیر توصیه می شود:
کروماتوگرافی لایه نازک (تکمیلی)
