کالیبراسیون و رگرسیون

   کالیبراسیون به مجموعه کارهایی که بر اساس یک روش مشخصی برای مقایسه نتایج یک دستگاه با یک دستگاه دقیق تر یا یک روش استاندارد (ابزار دقیق) برای تشخیص خطا، تنظیم دستگاه و یکسان سازی گزارشات آنالیزی به کار می روند، اطلاق می شود. به طور کلی هدف از کالیبراسیون اطمینان از صحت (accuracy) نتایج مشاهده شده روش آنالیزی است. کالیبراسیون و رگرسیون در روش های آنالیزی  در مفاهیمی نزدیک به هم دارند.

کالیبراسیون یک مفهوم بسیار گسترده است که کلیه مراحل آنالیز از شرایط نگهداری دستگاه آنالیزی تا چک کردن کلیه قطعات الکترونیکی و .. را شامل می شود. در اینجا به طور خاص کالیبراسیون در روش های آنالیز و به ویژه در اندازه گیری های کمی (Quantitative) مد نظر است که در آن کالیبراسیون شامل ایجاد یک رابطه بین پاسخ دستگاه و مقادیر استاندارد است.

   هدف هر آنالیزی تولید داده های قابل اعتماد (reliable) با حداقل خطاست. برای بسیاری از دستگاه های آنالیزی، رسم منحنی کالیبراسیون برای اندازه گیری کمی الزامی ست. روش های کالیبراسیون برای ارزیابی و تنظیم دقت و صحت دسنگاه ها و تجهیزات اندازه گیری به کار می روند.

کالیبراسیون و رگرسیون

   روش های رگرسیون (Regression) یکی از عمومی ترین روش های آماری استفاده شده برای کالیبراسیون هستند. روش های رگرسیون استفاده گسترده ای در حیطه های مختلف دارند از مطالعات شیمیایی مواد و تحقیق و توسعه ترکیبات جدید تا بازاریابی و مطالعات اجتماعی و روانشناسی. رگرسیون تکنیکی ست که برای مدل سازی و آنالیز داده های عددی شامل یک متغیر وابسته (Y) و یک یا چند متغیر مستقل (X) به کار می رود. هدف هر روش رگرسیونی می تواند ارائه مدل به منظور توصیف رابطه Y و X باشد و یا پیش بینی (prediction) مقادیر Y برای نمونه های جدید.

   معمولا فرض اولیه را بر خطی بودن رابطه بین متغیر های وابسته و مستقل در نظر می گیرند و بنابراین رگرسیون خطی بسیار متداول تر بوده و کاربرد بیشتری از روش رگرسیون غیرخطی دارند. مفروضات اولیه روش های رگرسیون خطی شامل وجود رابطه خطی بین متغیر وابسته و متغیرهای مستقل، توزیع نرمال خطاها و  هم واریانسی (homoscedasticity) در طول بهترین خط برازش شده مستقل است.

   هم واریانسی (homoscedasticity) وضعیتی را توصیف می کند که واریانس خطای پاسخ (Y) نسبت به مقادیر متغیر مستقل ثابت باشد. به عبارت دیگر تغییرات واریانس در طول بهترین خط برازش شده ثابت باشد (شکل 1 الف).

   ناهم‌واریانسی (heteroscedastic) برعکس هم واریانسی، وضعیتی را توصیف می کند که واریانس خطای پاسخ نسبت به مقادیر متغیر مستقل ثابت نباشد. به عبارت دیگر تغییرات واریانس در طول بهترین خط برازش شده ثابت نیست و معمولا به شکل مخروط است (شکل1 ب).

شکل 1 الف: هم واریانسی و ب: ناهمواریانسی

 براساس تعداد متغیرهای مستقل (x) روش های کالیبراسیون به کالیبراسیون تک متغیره (Univariate calibration) و کالیبراسیون چند متغیره (Multivariate calibration) دسته تقسیم می شوند.

به طور کلی روش های کالیبراسیون در آنالیز به رابطه بین نمونه و اندازه سیگنال مرتبط است که با تابع آنالیزی ((x=f_s(Q)) ساختار یک گونه شیمیایی را به مقدار یا غلظت آن مربوط می سازد.

  رابطه بین کمیت آنالیت و پاسخ آشکارساز برای بسیاری از روش های آنالیزی خطی یا نزدیک به خطی ست. کالیبراسیون معمولا شامل رسم پاسخ دستگاه بر حسب مجموعه ای از نمونه ها با غلظت مشخص است. بنابراین متداول ترین روش کالیبراسیون روش رگرسیون خطی (linear regression) ست که در آن نقاط تجربی با استفاده از روش حداقل مربعات (least squares) به صورت خطی برازش می شوند. که معادله کلی آن با رابطه 1 نشان داده می شود:

       (1)                                               y_i = α + βx_i

در رابطه 1 β شیب (slope) خط و α عرض از مبدا (intercept) است. شیب خط و عرض از مبدا را می توان از روابط زیر به دست آورد:

(β = Σ [(x_i-x_mean)(y_i-y_mean)]/ Σ (x_i-x_mean)²                                 (2

(α =  y_mean– β*x_mean                                                                       (3

 در رابطه های 2 و 3 X_mean و y_mean به ترتیب مقادیر میانگین X و y هستند.

 در بیشتر مواقع α و β با روش روش حداقل مربعات جزیی (least squares) به دست می آیند. اساس این روش به حداقل رساندن مجموع مربعات باقی مانده (sum of squares of residuals) یا SSR است. دقت شود در روش SSR پیدا کردن بهترین منحنی (best curve) بسیار با اهمیت است.

                                          شکل 2 رگرسیون خطی و مفاهیم اولیه آن

بر اساس رابطه 1 مقادیر برازش شده (Fitted values) به دست می آید. مقدار باقی مانده برابر با اختلاف مقادیر مشاهده شده (تجربی) با مقادیر برازش شده است. شکل 2 این مفاهیم را به صورت شماتیک نشان می دهد.

برای ارزیابی مدل رگرسیون ار پارامترهای تناسب برازش (goodness of fit) استفاده می شود. متداول ترین این پارامترها از روابط زیر محاسبه می شوند:

 

(Total SS = Σ(y_{observed i}– y_mean)²                              (4

(Model SS = Σ(y_{fitted i} – y_mean)²                                 (5

(Residual SS = Total SS – Model SS                        (6

(R² = Model SS /Total SS                                   (7

  Total SS یا مجموع مربعات کل (Total Sum of Squares)

Model SS یا مجموع مربعات مدل (Model Sum of Squares)

Residual SS مجموع مربعات باقی مانده (Residual Sum of Squares)

 و R² مربع ضریب همبستگی (r) هستند.

   R² میزان تغییرات متغیر y که می تواند توسط متغیر x تبیین شود را نشان می دهد. مقدار R² بین صفر و یک تغییر می کند. مقدار R² برابر با 1 یعنی تناسب کامل صورت گرفته و مقدار R² برابر با 0 یعنی هیچ رابطه ای بین داده ها وجود ندارد. شکل 3 حالت های مختلف  ضریب همبستگی (r) را نشان می دهد. همان طور که در شکل 3 نشان داده شده است مقادیر بالای  R² الزاما تضمین کننده یک مدل پیش بینی کننده خوب نیست و تایید نهایی مدل نیاز به ارزیابی دقیق تری دارد.

 

شکل 3 حالت های مختلف ضریب همبستگی

بعد از رسم منحنی کالیبراسیون و برازش داده ها رسم نمودار باقی مانده برای ارزیابی منحنی کایبراسیون بسیار مفید است. برای هر غلظت مقدار باقی مانده از اختلاف پاسخ دستگاه و پاسخ پیش بینی شده از منحنی کالیبراسیون به دست می آید. شکل 4 نمودار باقی مانده و حالت های مختلف آن را نشان می دهد. نمودار باقی مانده باید به صورت پراکندگی تصادفی نقاط حول محور افقی در صفر  رسم می شود (شکل4 الف). در غیر این صورت (شکل4 ب تا د) باید با برطرف کردن مشکل اقدام کرد.

 

کالیبراسیون تک متغیره

   کالیبراسیون تک متغیره (Univariate calibration)، یا کالیبراسیون تک جزئی (single-component calibration)، روش بسیار شناخته شده و متداولی ست که سنگ بنای بسیاری از آنالیزهای کمی ست.

   کالیبراسیون بر اساس رگرسیون خطی تک متغیره، چند فرض مهم را باید در نظر داشت: گزینش پذیری (Selectivity) و خطی بودن (Linearity). یک مدل کالیبراسیون تک متغیره فقط وقتی نتایج صحیحی دارد که سیگنال فقط ناشی از حضور آنالیت باشد نه عوامل دیگر. اگر عوامل یا آنالیت های دیگری سبب تغییر سیگنال شوند در روش تک متغیره هیچ راهی برای تشخیص آنها وجود ندارد و بنابراین نتایج ناصحیحی به دست خواهد آمد. باید یک رابطه خطی نیز بین مقدار کمی (غلظت) و سیگنال یا پاسخ دستگاه وجود داشته باشد. اگر رابطه خطی نباشد می توان از روش های کالیبراسیون تک متغیره غیرخطی استفاده کرد.

روش های کالیبراسیون متفاوتی برای روش های آنالیزی پیشنهاد شده است. سه روش استاندارد خارجی، افزایش استاندارد و استاندارد داخلی از روش های رایج تر و متداول در روش های آنالیزی هستند که در ادامه هر کدام به همراه معایب و مزایا هر روش مورد بررسی قرار می گیرند. دقت شود به منحنی کالیبراسیون (Calibration curve) منحنی تجزیه ای (analytical curve) یا منحنی کار (working curve) نیز می گویند.

 کالیبراسیون خارجی

   روش کالیبراسیون خارجی (External calibration)،متداول ترین روش در اندازه گیری های کمی ست. در این روش یک یا چند استاندارد با غلظت مشخص از آنالیت مورد نظر، تحت شرایط دستگاهی و آزمایشگاهی مشابه نمونه ها، آنالیز می شود. پاسخ دستگاه برای استانداردهای با مقادیر معلوم با پاسخ نمونه های مجهول با هم مقایسه می شوند.

برای انجام کالیبراسیون خارجی وجود شرایط زیر الزامی ست:

• سیگنال یا پاسخ متناسب با غلظت باشد.
• حساسیت دستگاه برای نمونه ها و استاندارد یکسان باشد.
• سیگنال فقط در نتیجه حضور و وجود آنالیت مورد نظر باشد.
• اثرات ماتریس نمونه و افت دستگاهی (instrumental drift) در سیگنال منظور نگردد.

برای این منظور منحنی کالیبراسیون حاصل ازپاسخ های دستگاه بر حسب مقدار آنالیت ها در استاندارد رسم می شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده و با اندازه گیری ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه مجهول مقدار دقیق آنالیت محاسبه می شود.

مزیت استفاده از روش استاندارد خارجی سادگی آن است و قابلیت استفاده برای روش های مختلف را داراست اما این روش معمولا تحت تاثیر شرایط آزمایش مزاحمت ها و  پایداری آشکارساز قرار می گیرد. بنابراین در مواقعی که مزاحمت عمده ای برای جزء آنالیزی وجود دارد یا نمونه ماتریس پیچیده ای دارد صحت و دقت چندان مناسبی ندارد.

افزایش استاندارد

در روش کالیبراسیون با افزایش استاندارد (standard addition calibration) مقدار مشخصی از آنالیت به نمونه ها اضافه می شود. سیگنال دستگاه به صورت تابعی از غلظت اضافه شده اندازه گیری می شود. در این روش مزاحمت های ماتریسی نمونه حذف می شوند اما کاهش حساسیت ناشی از افت دستگاه تصحیح نمی شود. شکل 5 به صورت شماتیک مراحل روش افزایش استاندارد و منحنی مربوطه را نشان می دهد.

استاندارد داخلی

در روش کالیبراسیون استاندارد داخلی (Internal Standard) یک ماده شناخته شده به عنوان استاندارد داخلی  به همه نمونه ها و استانداردها اضافه می شود. در این روش از فاکتور پاسخ (response factor) یا فاکتور پاسخ نسبی (relative response factor) که به صورت زیر تعریف می شوند استفاده می شود.

Response factor for analyt (RF_A)=(سیگنال آنالیت)/ (غلظت آنالیت)

Response factor for internal standard (RF_is)=(سیگنال استاندارد داخلی)/(غلظت استاندارد داخلی)

relative response factor= RF_A/ RF_is

• بهتر است استاندارد داخلی از نطر شیمیایی مشابه آنالیت باشد.
• برای تصحیح افت (تغییرات حساسیت با زمان) و کم کردن اثرات ماتریسی به کار می رود.