کروماتوگرافی یونی (ion chromatography, IC) یا کروماتوگرافی تبادل یونی یا کروماتوگرافی تعویض یونی (Ion-exchange chromatography, IEC) روشی کارآمد برای جداسازی و اندازه گیری یون هاست. این روش با توسعه رزین های تبادل یونی سنتزی رشد چشم گیری داشته و کاربردهای زیادی در زمینه های مختلف داشته است. متداول ترین روش برای خالص سازی پروتئین ها و بیو مولکول های باردار دیگر مانند اسید نوکلئیک ها و اسیدهای آمینه است. همچنین برای جداسازی و اندازه گیری یون های معدنی مانند اکتنیدها و لانتانیدها نیز به کار می روند.
مکانیسم بازداری نمونه بر اساس برهم کنش های یونی ست. در این روش بین فاز متحرک، که معمولا به صورت محلول است و حاوی نمونه ای ست که دارای اجزاء قابل یونیزه می باشد، و فاز ساکن، که باردار است، به صورت تعادلی و برگشت پذیر تبادل یون انجام می شود. اگرچه از تبادل گرهای یونی طبیعی مانند زئولیت ها (Zeolite) برای چندین دهه به عنوان فاز ساکن استفاده می شد، اما در دستگاه های مدرن امروزی، به دلیل خواص مطلوب تر رزین های تبادل یونی سنتزی مانند پایداری مکانیکی و شیمیایی و یک نواختی اندازه ذرات، فاز ساکن به رزین های تبادل یونی سنتزی محدود شده است.
دستگاهوری کروماتوگرافی تبادل یونی
این روش از انواع روش های کروماتوگرافی مایع است بنابراین از نظر دستگاهوری و اجزاء و وظایف هرکدام مشابه روش HPLC است. تفاوت هایی دستگاهی که وجود دارد در ادامه شرح داده می شود.
مهم ترین تفاوت کروماتوگرافی تبادل یونی با انواع دیگر کروماتوگرافی فاز ساکن آن است. همان طور که گفته شد فاز ساکن رزین های تبادل یونی هستند و برهم کنش یونی بین یون های سطح فاز ساکن و یون های موجود در فاز متحرک اساس جداسازی ست. فاز ساکن و متحرک هر دو قطبی هستند. فاز ساکن از پلیمر های سنتزی شامل گروه های متصل باردار تشکیل شده است که این گروه های باردار می توانند گروه های آنیونی یا کاتیونی باشند. گروه های آنیونی پیوند شده با رزین، برای جداسازی گروه های کاتیونی به کار می روند و بر همین اساس به آنها تبادل گرهای تعویض کاتیونی (cation exchange)، و این روش را کروماتوگرافی تعویض کاتیونی گویند.
گروه های کاتیونی پیوند شده با رزین برای جداسازی گروه های آنیونی به کار می روند و بر همین اساس به تبادل گرهای تعویض آنیونی (anion exchange)، و این روش را کروماتوگرافی تعویض آنیونی گویند. پلیمرهای سنتری مورد استفاده معمولا پلی استایرن/دای وینیل بنزن پلی وینیل الکل و پلی متا اکریلات هستند.
تعدادی از تبادل گرهای کاتیونی و آنیونی مهم به همراه گروه عاملی آنها در جدول 1 ارائه شده اند.
جدول 1 تبادل گرهای کاتیونی و آنیونی به همراه گروه عاملی آنها
فاز متحرک معمولا بافرهایی با pH مشخص یا محلولی از یک یا چند نمک در آب است. گزینش پذیری به pH، دما، نوع نمک (بافر) و قدرت یونی فاز متحرک بستگی دارد. وقتی که فاز متحرک هدایت بالایی دارد سهم یون های آنالیت در سیگنال نهایی آنقدر کوچک است که در سیگنال زمینه فاز متحرک محو می شود. این مسئله وقتی از آشکارساز هدایت سنجی استفاده شود بسیار با اهمیت است. در این مواقع از تکنیک فرونشانی یونی (Ion suppression) برای حذف زمینه فاز متحرک استفاده می شود. ستون های فرو نشاننده یونی (Ion Suppressor column) ) ستون های تعویض یونی هستند که معمولا برای حذف یون های مزاحم فاز متحرک استفاده می شوند.
مراحل کروماتوگرافی تبادل یونی در شکل 1 به صورت شماتیک نشان داده شده است. قبل از بارگذاری یا تزریق نمونه به ستون، ستون حاوی تبادل گر کاتیونی یا آنیونی باید با یک بافر به تعادل رسانده می شود. مثلا برای رزین آنیونی این مرحله شامل پروتونه کردن رزین برای اطمینان از بار مثبت آن است. نمونه در بافری که نقش فاز متحرک را دارد باید در ستون بارگذاری شود. بافر باید هدایت کمی داشته باشد چون وجود هر نوع گونه باردار ممکن است در برهم کنش با رزین با نمونه رقابت کند. گونه های با بار مخالف به رزین برهم کنش یونی دارند و گونه های هم بار یا بدون بار نیز برهم کنشی ندارند. در مرحله بعد، ستون فقط با بافر شسته می شود تا گونه هایی که برهم کنشی با ستون ندارند از ستون شسته شوند. مرحله آخر شستن آنالیت های پیوند شده به ستون است که با گرادیان نمکی (salt gradient)، که در آن غلظت نمک به تدریج زیاد می شود، یا یک بافر با غلظت بالای نمک انجام می شود. گونه هایی که پیوند ضعیف تری دارند ابتدا شسته می شوند و گونه هایی که پیوند قوی تری با رزین دارند، با غلظت های بالاتر نمک شسته می شوند.
متداول ترین نوع آشکارساز در IEC آشکارساز هدایت سنجی (Conductivity) است. اگر چه آشکارساز ماوراء بنفش (Uv/Vis) و در موارد نادری که گونه مورد آنالیز خاصیت فلورسانسی داشته باشد، آشکارساز فلورسانس نیز به کار می روند.
کروماتوگرافی تعویض غشایی (MEC)
کروماتوگرافی تعویض غشایی (Membrane exchange chromatography) که در بعضی مراجع کروماتوگرافی غشایی (Membrane chromatography) نیز نامیده می شود کاربرد بسیار گسترده ای در خالص سازی پروتئین ها و زدودن پروتئین ها DNA ویروس ها و غیره دارد. این روش به ویژه برای خالص سازی پروتئین ها بسیار کارامد بوده و استفاده می شود. این روش برای غلبه بر محدودیت انتقال جرم رزین های تعویض یونی توسعه داده شده اند.
تقاضا برای مواد بیولوژیک با خلوص بالا رو به افزایش است که این نیازمند یک روش کروماتوگرافی تبادل یونی با تفکیک بالاست. یک راه برای افزایش تفکیک در کروماتوگرافی تعویض یونی کاهش اندازه دانه های پلیمرهای تعویض یون است که علی رغم افزایش تفکیک سبب کاهش سرعت جریان می شود. برای افزایش سرعت جریان باید فشار را بالا برد اما بسیاری از دستگاه های محدودیت فشار دارند و تا حد ویژه ای می توان فشار را افزایش داد.
استفاده از غشا تا حد زیادی مشکلات فوق را حل می کند. غشاهای مورد استفاده در کروماتوگرافی غشایی معمولا مواد متخلخلی هستند که به صورت شیمیایی با پلیمری باردار کاتیونی یا آنیونی اصلاح شده اند.
کروماتوگرافی غشایی تا صد برابر کارایی بهتری نسبت به کروماتوگرافی تعویض یونی کلاسیک دارد. محدودیتی در ظرفیت نداشته و در سرعت جریان های بالا نیز عملکرد بسیار خوبی دارند. بنابراین بسیار سریع تر بوده و برای خالص سازی حجم های زیاد کاربرد دارد.
نکات آنالیزی کروماتوگرافی تبادل یونی
- نتایج آنالیز به تغییرات pH بسیار وابسته است.
- محدوده غلظتی در حد ppm (قسمت در میلیون).
- فقط برهم کنش های یونی درگیر جداسازی هستند و بنابراین مزاحمت های ماتریسی نقش جدی در آنالیز ندارند.
- آشکارسازهای محدودی در کروماتوگرافی یونی قابل استفاده هستند.
زمینه های کاربردی IC
- جداسازی و آنالیز مولکول های زیستی باردار مانند پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک، آمینواسیدها و ..
- جداسازی و آنالیز گونه های باردار معدنی مانند یون فلزات اکتنیدها و لانتانیدها
- آنالیز آنیونهای فلورید، کلرید، نیترات و سولفات و کاتیون های فلزی لیتیم، سدیم، آمونیوم و پتاسیم
- اندازه گیری نمک و شکر در مواد غذایی
- آنالیز آب
