شستشو و بازیابی ستون های بر پایه سیلیکا HPLC

 شما می توانید مطالب علمی و کاربردی خود را در زمینه آنالیز مواد از طریق آنالیوم به اشتراک بگذارید

مطالب ارسالی بر اساس درخواست شما در بخش علمی آموزشی یا دانلودهای تخصصی قرار داده می شود. جهت کسب اطلاعات با ما تماس بگیرید

یک ستون آلوده باید تمیز و احیا شود تا به حالت اولیه خود بازگردد. در این مطلب شستشو و بازیابی ستونهای بر پایه سیلیکا HPLC  آلوده به حالت اولیه خود – یا نزدیک به آن – می پردازد. از آنجا که ستونهای بر پایه سیلیکا HPLC پرکاربردترین هستند، روی آنها تمرکز می کنیم.

شستشو و بازیابی ستونهای بر پایه سیلیکا HPLC

استفاده روتین از ستون های محافظ برای محافظت از ستون های HPLC در برابر انسداد فریت و جذب نمونه به صورت غیرقابل برگشت به شدت توصیه می شود. با این حال، حتی با استفاده از کارتریج‌های محافظ، ممکن است در طی یک دوره زمانی ستون‌ها توسط اجزای نمونه به شدت جذب شده آلوده شوند. این آلودگی ممکن است با افزایش فشار برگشتی به صورت پیوسته، افزایش ناگهانی فشار برگشتی، از دست دادن کارایی ستون، دنباله دارشدن (tailing) و شانه دار شدن (shouldering) یا حتی شکافتگی پیک خود را نشان دهد.

کروماتوگرام ستون آلوده
کروماتوگرام ستون آلوده

به منظور به حداکثر رساندن طول عمر ستون، به ویژه ستون های UHPLC، نکات زیر باید در نظر گرفته شود:

  • فقط از حلال های فوق خالص درجه UHPLC/HPLC استفاده کنید.
  • از فازهای متحرک آبی تازه آماده شده برای جلوگیری از رشد باکتری استفاده کنید.
  • تمام نمونه ها، استانداردها و فازهای متحرک را فیلتر کنید (به عنوان مثال با فیلتر 0/2μm)
  • پاکسازی (cleanup) نمونه را درمورد نمونه های کثیف انجام دهید.
  • دبی فاز متحرک عبوری از ستون مقداری باشد که فشار ایجاد شده پشت ستون بسیار کمتر از حداکثر فشار توصیه شده از طرف شرکت سازنده ستون باشد.
  • همیشه از ستون محافظ استفاده کنید. این کار باعث می شود تمام اجزایی از نمونه و فاز متحرک که با فاز متحرک شسته نمی شوند در ستون محافظ جمع می شوند.
  • از بافرهای با غلظت کم ( 0/1M >) و pH بین حداقل و حداکثر مشخص شده ستون، ارائه شده توسط سازنده استفاده کنید.
  • هرگز یک فاز متحرک بافری را درون ستون رها نکنید، تا از هر گونه تبلور نمک بافر جلوگیری شود، رسوب نمک بافر بر کیفیت و طول عمر ستون تأثیر می گذارد.
  • چرخاندن شیر تزریق باید در سریع ترین زمان ممکن انجام شود. اگر شیر تزریق خیلی آهسته در دبی بالا بچرخد، یک موج فشار بوجود می آید که باعث ایجاد حفره در پرکننده ستون و همچنین موجب دوشاخه شدن پیک ها می شود.
  • از وارد آمدن ضربات فیزیکی به ستون جلوگیری کنید، همچنین اگر ستون فوراً با دبی و فشار بالا راه اندازی شود، یک موج فشاری بد ایجاد می شود که باعث ایجاد حفره (Void volume) در پرکننده خواهد شد.
  • ستون را فقط با نوع اتصالات توصیه شده به سیستم متصل کنید، اتصالات باید در شرایط خوبی باشند.
  • ستون محافظ را به موقع تعویض کنید (قبل از اینکه فشار پشت ستون بالا برود) و ستون را با سری صحیح مخلوط حلال های شستشو دهنده بازیابی کنید.

 

نکاتی در مورد شستشوی ستون

  • درصورت بد شدن عملکرد ستون یا افزایش فشار برگشتی، می توان با استفاده از مجموعه ای از یک سری حلال های قوی، یک روش تمیز کردن یا بازیابی ستون را انجام داد. اکیداً توصیه می شود قبل از انجام این روش، دستورالعمل های “مراقبت و استفاده” ارائه شده توسط سازنده ستون را بخوانید.
  • در حالی که اکثر ستون های با اندازه ذرات 3، 5 و 10 میکرومتر را می توان با معکوس کردن ستون شست و شو داد، اگر روی ستون جهت جریان مشخص شده باشد، قبل از معکوس کردن ستون، با استفاده از دفترچه راهنما، وب سایت سازنده یا مشورت با گروه پشتیبانی فنی باید مطمئن شویم که این کار مشکلی ایجاد نمی کند.
  • توصیه می شود راندمان ستون قبل و بعد از هر روش پاکسازی یا نگهداری طولانی مدت با استفاده از شرایط تست ستونی که در کروماتوگرام آزمایشی سازنده داده شده است یا شرایط روشی که دنبال می شود اندازه گیری شود. این امر امکان نظارت بر اثربخشی هر روش تمیز کردن را فراهم می کند.

 

مراحل تمیز کردن ستون

روش های کلی زیر برای بازسازی عملکرد ستون توصیه می شود.

  • در صورت لزوم ستون را معکوس کنید
  • خروجی ستون را از آشکارساز جدا کنید
  • روش شستشوی مناسب را برای هر نوع ستون با استفاده از 10-20 حجم ستون از هر حلال دنبال کنید (جدول 1). همیشه مطمئن شوید که آخرین حلال استفاده شده با فاز متحرک سازگار و قابل اختلاط می باشد.

جدول  1- حجم ستون در ستون های تجزیه ای

حجم ستون

(میلی لیتر)

اندازه ستون

( میلی متر)

2/5 4/6 *  250
1/5 4/6 * 150
0/64 3/0 * 150
0/28 2/1 * 150
0/50 4/6 * 50
0/30 4/6 * 30
0/15 4/6 * 15

 

کلید بازیابی ستون HPLC آلوده، آگاهی از ماهیت آلاینده ها و یافتن حلال مناسب است که آنها را حذف می کند.

هنگامی که آلودگی روی ستون ناشی از تجمع مواد باقی مانده از تزریق مکرر باشد، اغلب یک فرایند شستشوی ساده برای از بین بردن این آلاینده ها می تواند عملکرد ستون را بازیابی کند. گاهی اوقات، پس از عمل ایزوکراتیک، شستشو ستون های HPLC به اندازه 20 برابر حجم ستون با90 تا 100٪ حلال B (حلال قوی تر در سیستم فاز معکوس دوتایی) می تواند آلودگی ها را حذف کند. گاهی اوقات، حلال قوی ( حلال B) که به عنوان فاز متحرک در فرایند جداسازی استفاده شده است برای حذف آلاینده های روی ستون کافی نیست. و برای تمیز کردن ستون، به حلال قوی تر یا یک سری حلال ها نیاز است.

ترتیب حلالی برای شستشو و بازیابی ستونهای HPLC

ستون‌های فاز معکوس پیوندی (مثلاً C18،C8،C4، فنیل، CN)

الف) فاز متحرک بدون بافر

ب) متانول

ج) استونیتریل

د) استونیتریل/ ایزوپروپیل الکل (25:75)

ه) ایزوپروپیل الکل

و) دی کلرومتان

ز) هگزان

در بسیاری از موارد، شستشوی و بازیابی ستون های HPLC با سری حلال از (الف) تا (ه) می تواندکافی باشد در صورت ضروری بودن شستشو با حلال های دی کلرومتان و هگزان، قبل از بازگشت به فاز متحرک با ایزوپروپیل الکل شستشو دهید.

اگر آلودگی ستون با یون های فلزی می باشد، با EDTA آبی M 0/05 و سپس آب شستشو دهید.

ستون‌های فاز نرمال پیوندی (CN، NH2، Diol)

الف) کلروفرم

ب)  ایزوپروپیل الکل

ج) متیلن کلرید

د) هگزان

ستون های تبادل آنیون (SAX، WAX)

الف) آب

ب) متانول

ج) کلروفرم

د) متانول

ه) آب

ستون‌های فاز معکوس که برای آنالیز پروتئین/پپتید استفاده می‌شوند

الف) فاز متحرک بدون بافر

ب) گرادیان 10 تا 90 درصد B

در حالی که

حلال A  0/1% TFA  در آب

حلال B 0/1% TFA  در استونیتریل

ستون های تبادل کاتیونی (SCX، WCX)

الف) آب (چهار بار تزریق 200 میکرولیتر  DMSO در حین شستشو)

ب) تتراهیدروفوران

ستون های سیلیکا بدون پیوند

الف)  ایزوپروپیل الکل

ب) متانول

ج) اتیل استات

ستون های طرد اندازه (Size Exclusion) برای پروتئین ها

برای پروتئین های ضعیف بازداری شده

الف) بافر فسفات 0/1 مولار  pH 3

برای پروتئین هایی که به شدت بازداری شده اند

الف) گرادیان 100 درصد آب تا 100 درصد استونیتریل در 60 دقیقه

مقالات مرتبط

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *