کروماتوگرافی اندازه طردی که با عناوین کروماتوگرافی ژل تراوایی (Gel permeation chromatography, GPC) و یا کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (Gel Filtration Chromatography, GFC) نیز مترادف است، تکنیکی قوی برای جداسازی و آنالیز ترکیبات با جرم مولکولی بالاست. این روش در سال 1954 معرفی شد و در سال 1959 توسعه داده شد. در این روش جداسازی بر مبنای اندازه موثر و شکل مولکول ها صورت می گیرد و برخلاف دیگر روش های کروماتوگرافی، برهم کنش های شیمیایی یا فیزیکی آنالیت با فاز ساکن در جداسازی دخیل نیست و حتی از این برهم کنش ها به علت کاهش کارایی ستون باید اجتناب شود.
کروماتوگرافی اندازه طردی
دستگاهوری SEC
کروماتوگرافی اندازه طردی از انواع روش های کروماتوگرافی مایع است بنابراین از نظر دستگاهوری و اجزاء و وظایف هرکدام مشابه روش HPLC است. تفاوت هایی دستگاهی که وجود دارد در ادامه شرح داده می شود.
فازهای ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی اندازه طردی، مواد متخلخل با اندازه منافذ كنترل شده می باشند که اجزاء نمونه بر اساس اختلاف در اندازه مولکولی از هم تفکیک می شوند. در واقع فاز ساکن در این روش شبیه یک غربال یا الک مولکولی رفتار می کند. مولکول های کوچک تر از اندازه منافذ فاز ساکن وارد آنها می شوند و مولکول های بزرگتر از اندازه منافذ دفع یا طرد می گردند. بالاترین جرم مولکولی یک گونه که می تواند وارد منافذ شود را حد طرد (exclusion limit) گویند.
مولکول های بزرگتر از حد طرد توسط ستون بازداری نشده و سریع تر از ستون خارج می شوند ولی مولکول های کوچک تر در داخل و خارج منافذ پخش شده و دیرتر از ستون خارج می شوند. مولکول های با اندازه های مختلف با سرعت های متفاوت از ستون خارج می شوند. ترکیباتی که اصلا وارد منافذ نمی‌شوند و همچنین مولکول‌های کوچکی که کاملا در منافذ نفوذ می‌کنند، از یکدیگر جدا نمی‌شوند. مولکول‌های با اندازه متوسط، بر حسب درجه نفوذ آنها در خلل و فرج فاز ساکن در ستون نگه داشته می‌شوند.
اگر مواد ترکیب شیمیایی مشابه داشته باشند، به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون شسته می‌شوند. از آن جایی که اندازه مولکول نسبت مستقیم با جرم آن دارد، مولکولی های با وزن کمتر بیشتر از مولکول های با جرم زیاد در ستون نگه داشته می شوند. بنابراین در کروماتوگرام SEC پیک های ابتدایی مربوط به مولکول های بزرگتر و پیک های نهایی مربوط به مولکول های کوچک تر با زمان بازداری مشخص هستند. شکل 1 مکانیسم جداسازی در روش SEC را به صورت شماتیک نشان می دهد.
دو نوع فاز ساکن در SEC استفاده می شود: دانه های پلیمری (Polymer beads) و ذرات پایه سیلیکایی (Silica-based particle)، که معمولا قطری بین 5-10 میکرومتر دارند. ذرات با پایه سیلیکا راحت تر فشرده شده و در فشار بالا قابل استفاده هستند، پایداری بالایی دارند که امکان استفاده از حلال های مختلف از جمله آب را مهیا می کند، تعادل سریع دارند و در دمای بالا نیز پایدارند. اما این ذرات تمایل به جذب سطحی حل شونده ها دارند و پتانسیل کاتالیز تخریب مولکول های حل شونده را دارند.
هم-بسپارهای (Copolymer) استیرن-دی وینیل بنزن با اتصالات عرضی (cross-linked) از فازهای ساکن متداول برای کروماتوگرافی اندازه طردی است. اندازه منافذ این پلیمرها با میزان اتصالات عرضی و مقدار دای وینیل بنزن در حین سنتز پلیمر قابل کنترل است، بنابراین این پلیمر با اندازه منافذ مختلف در دسترس است. ژل های استیرن-دی وینیل بنزن آب گریز (hydrophobic) هستند و فقط با فاز ساکن غیر آبی استفاده می شوند. ژل های آب دوست (hydrophilic) مانند پلی اکریل آمیدها یا دای وینیل بنزن سولفونه شده برای جداسازی مولکول های محلول در آب استفاده می شوند.
متداول ترین نوع آشکارساز در SEC آشکارساز ضریب شکست (Refractive Index, RI) است. آشکارساز پراش نور (light scattering detector) آشکارساز زیر قرمز (IR) و آشکارساز ماوراء بنفش (Uv/Vis) نیز در مواردی که آشکارساز RI کارساز نباشد. آشکارسازهای دیگر مانند آشکارساز فلورسانس و الکتروشیمیایی کمتر در این روش به کار می روند.
نکات آنالیزی SEC
– زمان آنالیز کوتاه، جداسازی مناسب و حساسیت خوب
– قابلیت اندازه گیری کمی و شناسایی کیفی
– به علت عدم برهم کنش با فاز متحرک و ساکن از دست رفتگی نمونه وجود ندارد.
– ستون به به علت عدم برهم کنش نمونه با فاز ساکن غیرفعال نمی شود (عمر ستون بالاتر است)
– به خاطر زمان کوتاه آنالیز، کروماتوگرام تعداد پیک های محدودی دارد.
– عدم جداسازی ترکیبات با اندازه یکسان مانند ایزومرها (isomers)
زمینه کاربردی SEC
- تعيين توزيع وزن مولکولی
- تصفیه و خالص سازی نمونه های بیولوژیکی مانند آنزیم ها، پروتئین ها، پلی ساخارید ها و اسیدهای نوکلئیک
- کنترل کیفی در صنعت پلیمر
- جداسازی همولوگ ها (homolog) و الیگومرها (oligomer)
- نمک زدایی از مواد بیولوژیک
