متانول و استونیتریل حلالهای آلی هستند که معمولاً به عنوان فاز متحرک در کروماتوگرافی فاز معکوس استفاده می شوند. خواص این دو حلال آلی متفاوت است، در ادامه 7 تفاوت متانول و استونیتریل را که هنگام استفاده از آنها برای آنالیز باید در نظر داشته باشید، بیان می کنیم.
7 تفاوت متانول و استونیتریل در استفاده برای کروماتوگرافی فاز معکوس
1- فشار پشت ستون
شکل 1 نمونه ای از نسبت حلال و فشار تحویل حلال را برای مخلوط های آب/استونیتریل و آب/متانول نشان می دهد.
با کاهش ویسکوزیته حلال به دلیل دمای ستون بالاتر، فشار نیز کمتر می‌شود. با تنظیم دمای ستون بین 25-40 درجه سانتیگراد و مقایسه فشارهای ستون برای آب/استونیتریل و آب/متانول، می بینیم که فشار برای متانول بیشتر است. هنگام تغییر فاز متحرک از استونیتریل به متانول، مقاومت فشار تجهیزات و ستون باید دوباره بررسی شود.
2- طیف جذبی
شکل. 2 و 3 طیف جذب دو نوع استونیتریل و دو نوع متانول، حلال تجاری با درجه HPLC و حلال با درجه بالا را نشان می دهد. در حلالهای آلی تجاری برای HPLC تقریباً تمام ناخالصی‌ها حذف می شوند که حلال جذب در محدوده‌های تعیین‌شده بین طول‌موج‌های مشخص نداشته باشد.
از شکل 2 می توان دید که جذب استونیتریل با درجه HPLC به ویژه در طول موج های کوتاه کم است. بنابراین این استونیتریل با درجه HPLC برای آنالیز با حساسیت بالا با آشکارساز UV در منطقه با طول موج کوتاه مناسب است. علاوه بر این، در حلالهای آلی که برای آنالیز LCMS تهیه می شوند، ناخالصی‌های جاذب UV و فلزات باقی‌مانده را حذف می‌کنند. این کار برای جلوگیری از نویز پس زمینه خاص در آنالیز LCMS می باشد. هنگام تغییر حلال آلی از استونیتریل به متانول در آنالیز گرادیان، پیک های شبح (ghost peak) ممکن است به دلیل شرایط آنالیزی در محدوده طول موج کوتاه UV دیده شوند. در این مورد، توصیه می کنیم در درجه حلال مورد استفاده تجدید نظر کنید.
3- قدرت شستشو
شکل 4 نمونه ای از جداسازی پارابن ها (که p-هیدروکسی بنزوئیک اسید می باشند) را با ستون ODS نشان می دهد. می توان مشاهده کرد که وقتی استونیتریل و متانول با آب به نسبت یکسان مخلوط می شوند، فاز متحرک استونیتریل قدرت شستشوی بیشتری را نشان می دهد.
نوموگرام در شکل 5 نسبت متانول و استونیتریل به آب را با قدرت حلال معادل نشان می دهد که برای محاسبه تقریبی قدرت شستشو هنگام تغییر بین این حلال ها مفید است. اگر قبلاً از استونیتریل به عنوان فاز متحرک با نسبت آب 50/50 (v/v) استفاده می کردیم، هنگام تغییر به متانول، نسبت معادل متانول به آب 60/40 (v/v) خواهد بود.
4- گزینش پذیری جداسازی
گزینش پذیری جداسازی استونیتریل و متانول متفاوت است، اما از آنجایی که گزینش پذیری به خواص ترکیب محلول بستگی دارد، اینطور نیست که گزینش پذیری همیشه برای یکی یا دیگری بالاتر باشد. در جداسازی ایزومرهای موقعیتی، ستون‌های فنیل ممکن است مناسب‌ترین ستون‌ها برای کروماتوگرافی فاز معکوس باشند. علاوه بر فعل و انفعالات آبگریز، برهمکنش های π-π فاز ثابت فنیل به جداسازی کمک می کند. شکل 6 نمونه ای از جداسازی ایزومرهای موقعیتی کرزول را نشان می دهد. استونیتریل (CH3-C≡N) دارای پیوند C-N سه گانه و بنابراین الکترون های π است، در حالی که متانول (CH3-OH) هیچ الکترون π ندارد. برای یک ستون فنیل، استفاده از متانول به عنوان فاز متحرک، امکان برهمکنش π-π را فراهم می کند، که جداسازی را بهبود می بخشد.
5- تفاوت متانول و استونیتریل در رفتار بازداری
متانول و استونیتریل خواص شیمیایی متفاوتی دارند. متانول یک حلال پروتیک است، در حالی که استونیتریل یک حلال غیر پروتیک است، بنابراین می دانیم که رفتار شستشوی آنها متفاوت خواهد بود. اگر جداسازی کافی را نتوان با فاز متحرک مبتنی بر استونیتریل به دست آورد، تغییر به فاز متحرک مبتنی بر متانول برای تغییر ترتیب شستشو یک امکان مفید برای توسعه روش است.
شکل 7 نمونه ای از تفاوت متانول یا استونیتریل در جداسازی ترکیبات را نشان می دهد که در آن یک اتم هیدروژن از یک حلقه بنزن با یک گروه کربوکسیل یا یک گروه هیدروکسیل جایگزین شده است. وقتی این سه ترکیب به مقدار برابر در نمونه باشند، می توان دید که ترتیب شستشوی فنل و بنزوئیک اسید بسته به حلال مورد استفاده تغییر می کند. بسته به نوع ستون، ممکن است اثرات جانبی از گروه های عاملی قطبی از مواد پرکننده ستون، علاوه بر گروه های عاملی اصلاح شده شیمیایی مانند گروه های ODS و گروه های C8 (اکتیل) وجود داشته باشد. همچنین مواردی وجود دارد که حلالهای آلی و عوارض جانبی گروه‌های عاملی با هم تأثیر مثبتی دارند. شکل. 8 و 9 جداسازی 13 آنتی بیوتیک cephem را با استفاده از ستون فاز معکوس و استونیتریل یا متانول به ترتیب با شرایط تحلیلی یکسان در هر دو مورد نشان می دهد. بسته به استفاده از استونیتریل یا متانول، ترتیب نگهداری و شستشو متفاوت است. همچنین می دانیم که ترتیب شستشو بسته به فاز ساکن متفاوت است. به عنوان مثال، هنگام مقایسه ستون های ODS و C8، ستون C8 به طور کلی مقادیر بازداری کمتری دارد. با این حال، با توجه به گروه های عملکردی قطبی از مواد پرکننده، به سادگی این مورد نیست که بازداری همیشه کمتر است. رفتار بازداری نیز متفاوت است. از آنجایی که رفتار بازداری تحت تأثیر این عوامل مختلف است، لازم است ترکیب‌های مختلفی از فازهای متحرک و ثابت به منظور بهینه‌سازی شرایط تحلیل امتحان شود.
6- رسوب ناشی از اختلاط با یک بافر
در کروماتوگرافی فاز معکوس، بافرها با فازهای متحرک مبتنی بر آب استفاده می شوند. و برای استفاده با حلال های آلی مخلوط می شوند، اما بسته به نوع بافر و حلال های آلی، مقدار بسیار زیاد حلال های آلی ممکن است باعث رسوب نمک بافر شود. جداول 1 و 2 نشان می دهد که آیا رسوب برای مخلوط بافرهای پرکاربرد به ترتیب با استونیتریل یا متانول رخ می دهد یا خیر. مقادیر جدول نسبت (v/v) را نشان می دهد که در آن رسوب کردن شروع می شود. می بینیم که برای برخی از بافرها برای هیچ یک از حلال های آلی رسوب وجود ندارد، اما به طور کلی متانول باعث رسوب کمتری می شود.
*مقادیر نشان داده شده در جدول بسته به شرایط آزمایشگاهی ممکن است متفاوت باشد
** ”〇” به معنی عدم رسوب است.
7- گرمای واکنش حاصل از اختلاط با آب
برای شستشوی ایزوکراتیک، آب و حلال آلی از پیش مخلوط شده در بطری ذخیره به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. هنگامی که متانول با آب مخلوط می شود، واکنش گرمازایی نشان می دهد. در مقابل، استونیتریل به صورت گرماگیر واکنش نشان می دهد و بنابراین دمای مایع به زیر دمای اتاق خواهد رفت. با بازگشت تدریجی مخلوط استونیتریل به دمای اتاق، حباب هایی در مایع ایجاد می شود. همچنین، اگر مخلوط قبل از بازگشت به دمای اتاق به عنوان فاز متحرک استفاده شود، زمان بازداری سریعتر خواهد بود و با نزدیک شدن مایع به دمای اتاق تثبیت می شود. در همین حال متانول با مخلوط شدن با آب گرما تولید می کند که اثر گاز زدایی دارد. این بدان معناست که تهیه مخلوط آب و متانول به عنوان فاز متحرک نیاز به مراقبت کمتری نسبت به استونیتریل دارد.
خلاصه
در بالا 7 نکته کلیدی تفاوت متانول و استونیتریل به عنوان حلال آلی در آنالیز HPLC معرفی شد. از نظر کار آنالیز، تفاوت هایی در فشار ستون، جذب UV و سازگاری بافر وجود دارد و وقتی صحبت از جداسازی تجزیه ای به میان می آید، باید به قدرت شستشو، انتخاب جداسازی و رفتار بازداری توجه شود. درک این تفاوت ها در خواص شیمیایی متانول و استونیتریل، همراه با ترکیب ستون های مناسب، خطر بروز مشکلات در آنالیز HPLC را کاهش می دهد و کارایی توسعه روش را بهبود می بخشد.
